大蒜素誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　 惡性腫瘤己成為人類主要死亡因素,并有進(jìn)一步增高的趨勢(shì)。其中全球每年約有760,000人被診斷為胃癌。早期胃癌發(fā)病隱匿,或沒有特殊的臨床癥狀,所以,當(dāng)胃癌因有癥狀而被診斷時(shí),通常是胃癌晚期。胃癌的致病因素還不清楚,其中以下因素將增加胃癌的發(fā)病危險(xiǎn):年齡超過55歲,男性,高鹽飲食,高硝酸鹽類飲食,低維生素飲食,癌前病變,如惡性貧血、萎縮性胃炎、胃黏膜腸化生、李弗勞明綜合征及有胃腸惡性腫瘤家族史等因素均會(huì)增加胃癌的發(fā)病風(fēng)

2、險(xiǎn);相反,粗糧飲食、多食蔬菜、水果、高纖維素飲食將降低胃癌發(fā)病率。胃癌的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療等,迄今為止,手術(shù)一直是胃癌的第一選擇,化療對(duì)胃癌的作用有限。胃癌的預(yù)后較差,胃癌嚴(yán)重威脅人類健康。所以,早期診斷,預(yù)防和治療胃癌迫在眉睫。
　　 近年來,從傳統(tǒng)中藥和天然藥物中尋找和提取防治腫瘤的有效成分已成為治療腫瘤的希望和新途徑。大蒜素是大蒜中主要生物活性成分的總稱,為多種烯丙基有機(jī)硫化合物復(fù)合體,主要成分含50％～80

3、％的二烯丙基三硫化合物(DADS)、20％～50％的二丙烯二硫化合物(DAS)。Chester J.Cavallito最早于1944年從實(shí)驗(yàn)室中分離提純,現(xiàn)代藥物化學(xué)研究證明,大蒜素中所特有的有機(jī)含硫化合物,對(duì)許多革蘭陰性菌和革蘭陽性菌以及真菌有很強(qiáng)的殺菌作用。近年來國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期攝入大蒜可以降低惡性腫瘤(尤其是胃腸道和口腔惡性腫瘤)的發(fā)生率,多項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)居民食用大蒜的量與胃癌的發(fā)病率、胃癌死亡率呈顯著的負(fù)相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體細(xì)

4、胞試驗(yàn)中也證實(shí)大蒜及其提取成分具有良好的抗癌、防癌作用。
　　 關(guān)于大蒜素治療胃癌機(jī)制方面的研究,目前認(rèn)為大蒜素能阻斷致癌物的合成,抑制致癌物的活化并有抗突變、抗畸變作用。本科室前期研究表明,大蒜素可以促進(jìn)微管解聚,可提高促成熟因子(MPF)的重要成份cyclin B1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)并促進(jìn)其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移,使細(xì)胞周期阻滯于M期,即大蒜素治療胃癌與大蒜素參與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。但有關(guān)大蒜素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制,尚有待深入探討。

5、>　　 順鉑是最廣泛應(yīng)用一線抗腫瘤的化療藥物。由于順鉑的臨床療效與其應(yīng)用劑量相關(guān),大劑量應(yīng)用時(shí)的臨床毒副作用較大,限制了其臨床應(yīng)用,其療效仍有待于提高。提高順鉑的抗腫瘤療效,是臨床抗腫瘤治療面臨的實(shí)際問題。目前,在臨床化療中,常通過聯(lián)合用藥,以提高臨床治療療效。那么,大蒜素聯(lián)合順鉑能否發(fā)揮協(xié)同作用,對(duì)胃癌細(xì)胞有何影響,有待探討。
　　 本課題以胃癌SGC-7901細(xì)胞為模型,研究大蒜素誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用,探

6、討大蒜素誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡機(jī)制,研究大蒜素與順鉑聯(lián)合作用對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1、MTT法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞活力。
　　 2、倒置顯微鏡下觀察SGC-7901細(xì)胞形態(tài)。
　　 3、透射電鏡檢測(cè)大蒜素作用后SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 4、羅丹明123與碘化丙啶染色,熒光顯微鏡觀察SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響。

7、　　 5、膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)和碘化丙啶(PI)染色流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 6、羅丹明123染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membranepotential(△Ψm))。
　　 7、細(xì)胞免疫組化及western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。
　　 8、real-time PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處

8、理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS13.0軟件軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析,P＜0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:作用相同時(shí)間,隨著大蒜素濃度的增加對(duì)細(xì)胞活力的影響增加,大蒜素作用24小時(shí),15μg/ml,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響,是對(duì)照組的95.3±2.61％,120μg/ml,細(xì)胞活力是對(duì)照組的78.3±2.63％;相同濃度的大蒜素,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)大蒜素對(duì)細(xì)胞活

9、力影響增加,大蒜素30μg/ml作用24h時(shí),細(xì)胞活力是對(duì)照組的93.89±3.01％,大蒜素30μg/ml作用48h時(shí),細(xì)胞活力是對(duì)照組的70。1±4.5％,作用72h,細(xì)胞活力是對(duì)照組的60.1±2.5％。與大蒜素15μ/ml作用48h時(shí)相比較,大蒜素30μg/ml作用48h時(shí),細(xì)胞活力顯著下降。提示大蒜素以時(shí)間、濃度依賴性模式抑制SGC-7901細(xì)胞活性。
　　 2、倒置顯微鏡觀察,大蒜素組(大蒜素30μg/ml48h)細(xì)

10、胞體積變小,細(xì)胞呈圓形,死亡細(xì)胞明顯增加。
　　 3、透射電鏡觀察:對(duì)照組SGC-7901細(xì)胞形態(tài)規(guī)整,細(xì)胞核較大,線粒體豐富,膜結(jié)構(gòu)完整,可見細(xì)胞有大量纖毛;大蒜素組(大蒜素30μg/ml48h)凋亡細(xì)胞體積變小,胞質(zhì)濃縮,胞漿內(nèi)空泡增多,染色質(zhì)固縮、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀,線粒體腫脹,核膜不完整,出現(xiàn)凋亡小體。
　　 4、羅丹明123與碘化丙啶染色,熒光顯微鏡觀察,大蒜素30μg/ml作用48h,Rh123染色的熒光

11、強(qiáng)度低,細(xì)胞片段化,細(xì)胞核PI染色,熒光強(qiáng)度增加,表明細(xì)胞無活力,而對(duì)照組細(xì)胞未表現(xiàn)出上述特點(diǎn)。
　　 5、膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)染色流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為2.48±0.5％,大蒜素組(大蒜素30μg/ml48h)為15.14±1.5％,兩組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6、線粒體跨膜電位(△Ψm)檢測(cè):對(duì)照組

12、為90.81±3.48％,大蒜素30μg/ml作用48h組為47.75±5.41％,與對(duì)照組相比較,線粒體膜電位下降。
　　 7、細(xì)胞免疫組化和western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,大蒜素30μg/ml作用48h,細(xì)胞Caspase3,Bax,Cytochrome c,Fas和Caspase8蛋白表達(dá)均增加。
　　 8、Real-time PCR檢測(cè)表明:與對(duì)照組比較,大蒜素30μg/ml作用48h,Caspa

13、se3 mRNA、Bax mRNA,Cytochrome c mRNA和Fas mRNA表達(dá)增加。
　　 9、大蒜素與順鉑聯(lián)合用藥組,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:作用24h,細(xì)胞活力是對(duì)照組的81.12±3.58％,作用48h,細(xì)胞活力是對(duì)照組的42.33±3.86％,作用72h,細(xì)胞活力是對(duì)照組的22.12±4.12％,聯(lián)合用藥在抑制細(xì)胞活力方面發(fā)揮了協(xié)同作用,與對(duì)照組,單用大蒜素組,單用順鉑組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

14、10、羅丹明123與碘化丙啶染色,熒光顯微鏡觀察,聯(lián)合作用組細(xì)胞片段化,細(xì)胞核PI染色,熒光強(qiáng)度增加顯著,表明細(xì)胞無活力,而對(duì)照組細(xì)胞未表現(xiàn)出上述特點(diǎn)。
　　 11、膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,聯(lián)合用藥組(大蒜素30μg/ml,順鉑2μg/ml48h)為38.3±0.5％,對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為2.48±0.5％,大蒜素組(大蒜素30μg/ml48h)為15.14±1.5％,順鉑組(

15、順鉑2μg/ml48h)細(xì)胞凋亡率為30.96±0.5％,聯(lián)合用藥在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮了協(xié)同作用,與對(duì)照組,大蒜素組,順鉑組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 12、線粒體跨膜電位(△Ψm)檢測(cè):聯(lián)合用藥組作用48h為55.26±4.88％,對(duì)照組為90.81±3.48％,大蒜素30μg/ml作用48h為47.75±5.41％,順鉑組2μg/ml作用48h為71.88±4.26％,與對(duì)照組相比較,線粒體膜電位下降。
　　

16、 13、細(xì)胞免疫組化和western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,聯(lián)合用藥組作用48,細(xì)胞Caspase3,Bax,Cytochrome c,Fas和Caspase8蛋白表達(dá)均增加。
　　 結(jié)論：
　　 1、大蒜素能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。
　　 2、大蒜素可以通過促進(jìn)Bax、Cytochrome c的表達(dá),降低線粒體膜電位發(fā)生,活化Caspase3,激活內(nèi)源性線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起凋亡;
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