IL-8對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、研究背景:乳腺癌是女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一，全球每年約新增138萬(wàn)名乳腺癌患者，占女性新發(fā)腫瘤的30％。并且近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)。并已成為威脅女性生命的“頭號(hào)殺手”。乳腺癌是一種全身性疾病，早期手術(shù)是最主要的治療方法，而化療和放療是晚期患者治療的重要策略。腫瘤細(xì)胞的化療耐藥或放療抵抗是乳腺癌臨床治療的主要障礙，而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者治療失敗和引起癌癥病人生活質(zhì)量下降及死亡的主要原因。目前研究認(rèn)為，腫瘤

2、干細(xì)胞是腫瘤不斷生長(zhǎng)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源，腫瘤微環(huán)境在調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的自我更新、多向分化及耐藥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。深入研究腫瘤微環(huán)境中的信號(hào)分子及其傳導(dǎo)通路對(duì)腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，可為制定新的治療策略有效靶向腫瘤干細(xì)胞，減少腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。近年來(lái)，一種促炎細(xì)胞因子，CXC趨化因子8(CXCL8，又名白細(xì)胞介素8，interleukin8，IL-8)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用引起了研究者的高度關(guān)注。
　　目的:了解乳腺癌干細(xì)

3、胞IL-8及其受體特別是IL-8受體1(CXCR1)的表達(dá)情況;進(jìn)一步探索外源性高表達(dá)IL-8對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，為乳腺癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:首先，利用磁珠分選出乳腺癌MCF-7細(xì)胞中CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA或WesternBlot法檢測(cè)IL-8及其受體CXCR1的表達(dá)情況。然后，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)IL-8的真核表達(dá)載體（pcDNA3.1

4、/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒）;利用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)到MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清，qRT-PCR和ELISA方法檢測(cè)IL-8在MCF-7細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，WesternBlot檢測(cè)IL-8受體CXCR1表達(dá)的變化。進(jìn)一步利用CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)了解IL-8高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。最后，通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)了解MCF-7細(xì)胞高表達(dá)IL-8后乳腺癌細(xì)胞乳腺

5、球形成能力的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細(xì)胞所占比例的變化WesternBlot檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物如ALDH1、BMI1表達(dá)的變化;同時(shí)，將高表達(dá)IL-8的MCF-7細(xì)胞接種裸鼠，觀察裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況;接種后第21天，麻醉后取裸鼠外周血，ELISA法檢測(cè)IL-8水平的變化，取荷瘤裸鼠腫瘤組織，WesternBlot檢測(cè)腫瘤組織中IL-8受體CXCR1、ALDH1及BMI1表達(dá)的變化，免疫組

6、織化學(xué)檢測(cè)ALDH1表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.利用磁珠從乳腺癌MCF-7細(xì)胞中分選出CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩群細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24-細(xì)胞分泌的IL-8量明顯高于非CD44+/CD24-細(xì)胞，而qRT-PCR結(jié)果顯示在mRNA水平上CD44+/CD24-細(xì)胞的IL-8的表達(dá)低于非CD44+/CD24-細(xì)胞。qRT-PCR和WesternBlot檢測(cè)證實(shí)在mRNA和蛋白

7、水平上CD44+/CD24-細(xì)胞IL-8受體CXCR1的表達(dá)顯著高于非CD44+/CD24-細(xì)胞。
　　2.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)IL-8的真核表達(dá)載體(pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒)，并用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，并用qRT-PCR和ELISA法證實(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞IL-8mRNA和蛋白表達(dá)均升高。進(jìn)一步通過(guò)WesternBlot證實(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞IL-8受體CXCR1的表達(dá)也增加。

8、　　3.pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源性高表達(dá)IL-8對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有明顯影響;在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過(guò)基質(zhì)膠的MCF-7細(xì)胞數(shù)分別為:IL-8轉(zhuǎn)染組:（247.3±17.6）個(gè)/高倍鏡視野，無(wú)關(guān)序列組:（76.7±3.1）個(gè)/高倍鏡視野，空白對(duì)照組:（86.3±7.4）個(gè)/高倍鏡視野;在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù)分別

9、為:IL-8轉(zhuǎn)染組:（255.3±22.7）個(gè)/高倍鏡視野，無(wú)關(guān)序列組:（105.3±7.1）個(gè)/高倍鏡視野，空白對(duì)照組:（126.7±11.6）個(gè)/高倍鏡視野，提示，高表達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列或空白對(duì)照的MCF-7細(xì)胞，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.高表達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞形成乳腺球的體積、乳腺球的數(shù)量明顯高于空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)序列組;流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高表

10、達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中CD44+/CD24-比例為16.39％±0.56％，明顯高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列組的MCF-7細(xì)胞，其CD44+/CD24-的細(xì)胞比例分別為6.39％±0.59％，5.28％±1.1％;WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IL-8的乳腺癌MCF-7細(xì)胞乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1及BMI1的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列組細(xì)胞，提示高表達(dá)IL-8不但可上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的干細(xì)胞數(shù)量而

11、且還能增強(qiáng)其“干性”標(biāo)志物。進(jìn)一步體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn):裸鼠接種等數(shù)量的轉(zhuǎn)染IL-8或轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的MCF-7細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯快于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠。接種后第21天，轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠外周血中IL-8水平顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠，同時(shí)，轉(zhuǎn)染IL-8荷瘤裸鼠的瘤重為（4.93±0.3）g，顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列荷瘤裸鼠的瘤重（2.28±0.39）g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;WesternBl

12、ot檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織中IL-8受體CXCR1的表達(dá)顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠;免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤組織ALDH1的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠，且WesternBlot證實(shí)轉(zhuǎn)染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織IL-8受體CXCR1及乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)蛋白ALDH1及BMI1顯著高于轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的荷瘤裸鼠。
　　結(jié)論:
　　1.乳腺癌CD44+/CD24-干細(xì)胞可分泌IL-8