IL-8對乳腺癌干細胞的影響及其作用機制.pdf

1、研究背景:乳腺癌是女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一，全球每年約新增138萬名乳腺癌患者，占女性新發(fā)腫瘤的30％。并且近年來的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)病有年輕化的趨勢。并已成為威脅女性生命的“頭號殺手”。乳腺癌是一種全身性疾病，早期手術(shù)是最主要的治療方法，而化療和放療是晚期患者治療的重要策略。腫瘤細胞的化療耐藥或放療抵抗是乳腺癌臨床治療的主要障礙，而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者治療失敗和引起癌癥病人生活質(zhì)量下降及死亡的主要原因。目前研究認為，腫瘤

2、干細胞是腫瘤不斷生長及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源，腫瘤微環(huán)境在調(diào)控腫瘤干細胞的自我更新、多向分化及耐藥等過程中發(fā)揮重要作用。深入研究腫瘤微環(huán)境中的信號分子及其傳導(dǎo)通路對腫瘤干細胞的調(diào)控機制，可為制定新的治療策略有效靶向腫瘤干細胞，減少腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。近年來，一種促炎細胞因子，CXC趨化因子8(CXCL8，又名白細胞介素8，interleukin8，IL-8)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用引起了研究者的高度關(guān)注。
　　目的:了解乳腺癌干細

3、胞IL-8及其受體特別是IL-8受體1(CXCR1)的表達情況;進一步探索外源性高表達IL-8對乳腺癌干細胞的影響及其作用機制，為乳腺癌的防治提供實驗依據(jù)。
　　方法:首先，利用磁珠分選出乳腺癌MCF-7細胞中CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細胞，實時定量PCR、ELISA或WesternBlot法檢測IL-8及其受體CXCR1的表達情況。然后，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建高表達IL-8的真核表達載體（pcDNA3.1

4、/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒）;利用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)到MCF-7細胞，轉(zhuǎn)染后24h收集細胞及其培養(yǎng)上清，qRT-PCR和ELISA方法檢測IL-8在MCF-7細胞中的過表達，WesternBlot檢測IL-8受體CXCR1表達的變化。進一步利用CCK-8實驗、Transwell體外侵襲和遷移實驗了解IL-8高表達對MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。最后，通過成球?qū)嶒灹私釳CF-7細胞高表達IL-8后乳腺癌細胞乳腺

5、球形成能力的變化，流式細胞儀檢測CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細胞所占比例的變化WesternBlot檢測乳腺癌干細胞標記物如ALDH1、BMI1表達的變化;同時，將高表達IL-8的MCF-7細胞接種裸鼠，觀察裸鼠腫瘤生長情況;接種后第21天，麻醉后取裸鼠外周血，ELISA法檢測IL-8水平的變化，取荷瘤裸鼠腫瘤組織，WesternBlot檢測腫瘤組織中IL-8受體CXCR1、ALDH1及BMI1表達的變化，免疫組

6、織化學(xué)檢測ALDH1表達的變化。
　　結(jié)果:
　　1.利用磁珠從乳腺癌MCF-7細胞中分選出CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩群細胞后，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24-細胞分泌的IL-8量明顯高于非CD44+/CD24-細胞，而qRT-PCR結(jié)果顯示在mRNA水平上CD44+/CD24-細胞的IL-8的表達低于非CD44+/CD24-細胞。qRT-PCR和WesternBlot檢測證實在mRNA和蛋白

7、水平上CD44+/CD24-細胞IL-8受體CXCR1的表達顯著高于非CD44+/CD24-細胞。
　　2.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建高表達IL-8的真核表達載體(pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒)，并用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞中，并用qRT-PCR和ELISA法證實轉(zhuǎn)染后細胞IL-8mRNA和蛋白表達均升高。進一步通過WesternBlot證實轉(zhuǎn)染后細胞IL-8受體CXCR1的表達也增加。

8、　　3.pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后，CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)外源性高表達IL-8對乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力沒有明顯影響;在Transwell侵襲實驗中穿過基質(zhì)膠的MCF-7細胞數(shù)分別為:IL-8轉(zhuǎn)染組:（247.3±17.6）個/高倍鏡視野，無關(guān)序列組:（76.7±3.1）個/高倍鏡視野，空白對照組:（86.3±7.4）個/高倍鏡視野;在Transwell遷移實驗中穿過小室基底膜的細胞數(shù)分別

9、為:IL-8轉(zhuǎn)染組:（255.3±22.7）個/高倍鏡視野，無關(guān)序列組:（105.3±7.1）個/高倍鏡視野，空白對照組:（126.7±11.6）個/高倍鏡視野，提示，高表達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞的遷移和侵襲能力顯著高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列或空白對照的MCF-7細胞，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.高表達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞形成乳腺球的體積、乳腺球的數(shù)量明顯高于空白對照組和無關(guān)序列組;流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)高表

10、達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞中CD44+/CD24-比例為16.39％±0.56％，明顯高于空白對照組和轉(zhuǎn)染無關(guān)序列組的MCF-7細胞，其CD44+/CD24-的細胞比例分別為6.39％±0.59％，5.28％±1.1％;WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)高表達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞乳腺癌干細胞標記物ALDH1及BMI1的表達明顯高于空白對照組和轉(zhuǎn)染無關(guān)序列組細胞，提示高表達IL-8不但可上調(diào)乳腺癌MCF-7細胞中的干細胞數(shù)量而

11、且還能增強其“干性”標志物。進一步體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn):裸鼠接種等數(shù)量的轉(zhuǎn)染IL-8或轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的MCF-7細胞后，轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤的生長速度明顯快于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的荷瘤裸鼠。接種后第21天，轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠外周血中IL-8水平顯著高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的荷瘤裸鼠，同時，轉(zhuǎn)染IL-8荷瘤裸鼠的瘤重為（4.93±0.3）g，顯著高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列荷瘤裸鼠的瘤重（2.28±0.39）g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;WesternBl

12、ot檢測證實轉(zhuǎn)染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織中IL-8受體CXCR1的表達顯著高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的荷瘤裸鼠;免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤組織ALDH1的表達明顯高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的荷瘤裸鼠，且WesternBlot證實轉(zhuǎn)染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織IL-8受體CXCR1及乳腺癌干細胞的相關(guān)蛋白ALDH1及BMI1顯著高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的荷瘤裸鼠。
　　結(jié)論:
　　1.乳腺癌CD44+/CD24-干細胞可分泌IL-8