Hsa-miR-133a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及其機(jī)制.pdf

1、背景和目的:微小RNA(microRNA, miRNA)是由長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸組成的非編碼蛋白R(shí)NA,通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯或降解靶mRNA負(fù)性調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程,包括生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、細(xì)胞增殖、分化及腫瘤形成。前期研究結(jié)果顯示乳腺癌組織中miR-133a表達(dá)顯著下調(diào),并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。本課題擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討miR-133a對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響并闡明其作用機(jī)制。
　　方法:

2、r>　　(1)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將miR-133a模擬物(miR-133a mimics)及miR-133a阻遏物(miR-133a inhibitors)轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,分別以negative control(NC)和inhibitor negative control(inhibitor NC)作為陰性對(duì)照。通過(guò)MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和侵襲力;采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及

3、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。
　　(2)利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-133a的靶基因,并對(duì)其進(jìn)行基因功能分析。
　　(3)選取侵襲、遷移及粘附相關(guān)預(yù)測(cè)靶基因?yàn)檠芯磕繕?biāo):①M(fèi)CF-7轉(zhuǎn)染miR-133a mimics后,通過(guò)qRT-PCR及western-blot檢測(cè)目標(biāo)基因mRNA和蛋白表達(dá)。②克隆目標(biāo)基因FSCN13′UTR,將其與質(zhì)粒psiCHECK-2(含熒光素酶報(bào)告基因)連接后,與miR-133a mimics共轉(zhuǎn)染

4、MCF-7,進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(luciferase reporter assay,LRA)。
　　結(jié)果:
　　(1)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133a mimics后60h、84h、108h和132h(即細(xì)胞接種24h、48h、72h和96h)后,其增殖抑制率呈時(shí)間依賴性增加,依次為0.8％(與NC組比較,P>0.05)、8.3%、8.8%和18.7%(與NC組比較,均P<0.05)。而miR-133a inhibito

5、rs組與inhibitor NC組間細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　(2)Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,①轉(zhuǎn)染miR-133a mimics88h(即細(xì)胞接種28h)后,MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著降低,平均每低倍視野(×100)侵出小室的細(xì)胞數(shù)分別為NC組的0.303倍和0.204倍(均P<0.01);②轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitors80h(即細(xì)胞接種20h)后,MCF

6、-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力均顯著增強(qiáng),平均每低倍視野(×100)侵出小室的細(xì)胞數(shù)分別為inhibitor NC組的2.68倍和2.02倍(分別P<0.01和P<0.05)。
　　(3)劃痕后miR-133a inhibitors組MCF-7細(xì)胞遷移能力比inhibitor NC組顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　(4)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè) miR-133a的靶基因中,部分發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞侵襲、遷移的生物學(xué)功能。
　　(5)經(jīng)q

7、RT-PCR及western-blot實(shí)驗(yàn)篩選,結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-133a mimics48h及72h后,Fascin-1(FSCN1)基因mRNA(為NC組的56%,P<0.01)和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。
　　(6)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-133a可直接作用于FSCN1基因3′UTR。
　　結(jié)論:
　　(1)MiR-133a對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移存在負(fù)性調(diào)控作用。
　　(2)MiR-1