配體-量子點(diǎn)定位腎上腺素受體以及在藥物篩選中的應(yīng)用.pdf

1、本文第二章是用QD標(biāo)記的Prazosin定位α1A-AR。我們首次用QD標(biāo)記的Prazosin結(jié)合TIRFM定位了HEK293細(xì)胞膜上的α1A-AR。實(shí)驗(yàn)中以我們對(duì)Prazosin-biotin與QD-streptavidin的結(jié)合比例，Prazosin-biotin與QD-streptavidin的濃度，孵育時(shí)間等多種影響受體標(biāo)記的因素進(jìn)行了研究，確定了定位HEK293細(xì)胞膜上的α1A-AR的最佳條件，并且通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證明了QD-

2、streptavidin與Prazosin-biotin以及Prazosin-QD與α1A-AR結(jié)合的特異性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們觀測(cè)到溶液中的Prazosin-QD被細(xì)胞膜上的α1A-AR捕獲，QD熒光清楚的顯示了細(xì)胞膜上的α1A-AR，這就為QD用于藥物篩選打下了基礎(chǔ)。 本文第三章是QD標(biāo)記的PE來(lái)定位僅α1A-AR。我們研究了PE與生物素之間連接不同鏈長(zhǎng)的化合物時(shí)，PE與細(xì)胞表面α1A-AR結(jié)合的情況，發(fā)現(xiàn)在生物素與PE之間

3、的鏈越長(zhǎng)，越易于與細(xì)胞表面α1A-AR結(jié)合，反映了QD對(duì)于細(xì)胞表面受體一配體的結(jié)合存在空間位阻的影響。因此，我們選擇鏈最長(zhǎng)的PE(D)作為定位α1A-AR的激動(dòng)劑，并且用幾種方法證明了PE與α1A-AR結(jié)合的特異性。我們觀測(cè)了激動(dòng)劑PE和拮抗劑Prazosin與α1A-AR結(jié)合作用的差異，發(fā)現(xiàn)PE(D)-QD作用于受體后，熒光點(diǎn)分布在整個(gè)細(xì)胞中，而Prazosin-QD作用于受體后，熒光點(diǎn)只存在于細(xì)胞表面上。最后，我們用PE(D)-QD

4、孵育細(xì)胞，采用TIRFM在不同時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)了HEK293細(xì)胞α1A-AR的內(nèi)吞及生成的內(nèi)涵體，表明我們用QD標(biāo)記的PE仍具有藥理活性。通過(guò)上述研究，我們可以根據(jù)QD熒光標(biāo)記的激動(dòng)劑和拮抗劑作用于受體之后，所引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)的不同，在藥物篩選中進(jìn)行激動(dòng)劑和拮抗劑的區(qū)分。 本文第四章是我們首次采用QD標(biāo)記拮抗劑的方法來(lái)進(jìn)行藥物篩選。首先用Prazosin-QD來(lái)標(biāo)記HEK293細(xì)胞上的α1A-AR，然后用待篩選的藥物作用于HEK293

5、細(xì)胞，觀察細(xì)胞表面的熒光點(diǎn)分布變化。通過(guò)比較待篩選藥物作用于細(xì)胞之后細(xì)胞表面熒光點(diǎn)減少的程度，來(lái)相對(duì)比較待篩選藥物與α1A-AR的親和力大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五種待篩選的拮抗劑與α1A-AR的親和力的活性順序是Urapidil>Terazosin>Doxazosin>Phentolamine>Prazosin>Tamsulosin，這個(gè)藥物親和性順序與經(jīng)典的放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法得到的結(jié)果基本相同，說(shuō)明該方法可用來(lái)研究藥物與受體之間的相互