家蠶濃核病毒BmDNV-3基因組結構與功能的研究.pdf

1、濃核病毒無囊膜，直徑18～26nm，基因組大小約為4.0～6.5kb。該病毒內含有正負鏈單分子(ssDNA)，或為正鏈，或為互補的負鏈。濃核病毒具有高度的宿主特異性，并且在通常情況下能引起宿主的死亡。目前濃核病毒最為關注的是可作為生物殺蟲劑和表達載體表達外源蛋白。家蠶作為經(jīng)濟昆蟲的重要性，自上世紀80年代人們先后從同本(BuDNV-1、BaDNV-2、BmDNV-5)、中國鎮(zhèn)江(BaDNV-3)和印度(BeBNV-4)的家蠶中分離到了不

2、同株系DNVs。其中BmDNV-3和BmDNV-2(Yamanashi isolate)都擁有雙分子基因組(VDl，VD2)，并且感染相同的宿主，但在感受性、血清學上有差異，在宿主感染部位上也存在著不同。本論文中以BeilNV-3作為研究對象，對其基因組的結構和功能進行研究。主要結果如下： 1.濃核病毒BmDNV-3基因組中含有兩種沒有同源性的單鏈線形DNA分子(VDl，VD2)，這兩種核酸分子以單鏈(+VDl， -VDl；+V

3、D2， -VD2)線型方式被分開包裝在各自的衣殼蛋白中。該病毒DNAs在高鹽狀態(tài)下被分離、純化。用T4酶(300ngDNA/10U)補平抽提過程中復性為雙鏈的病毒DNAs，然后用HindIII進行酶切，酶切后的片段克隆到經(jīng)過HindIII和SmaI平端酶切的pUCll9載體上，完成了對該病毒的全基因組克隆和序列測定。序列裝配的結果顯示：VDl全基因組序列長為6543個核苷酸，末端擁有224個核苷酸術端反向重復序列；VD2全基因組序列長為

4、6022個核苷酸，末端擁有524個核苷酸木端反向重復序列。GenBank序列登錄號：[DQ017268；DQ017269]。 2.生物信息學分析顯示：VDl基因組正鏈含有3個大的開放閱讀框(ORFl～3)，ORFl和ORF2可能編碼非結構蛋白，因為它們含有細小病毒保守區(qū)域序列NTP-binding和DNA解旋酶結合域，而ORF3可能編碼結構蛋白，負鏈含有1個大的開放閱讀框(ORF4)，由于它與假定的DNA聚合酶有一定的同源性，因

5、此推測可能編碼非結構蛋白。對VDl ORF4的1115氨基酸序列與其它病毒DNA聚合酶基因氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)N端含有3個外切酶的保守區(qū)域與原核和真核生物3'5'外切酶相關，5個保守區(qū)域涉及到DNA聚合酶的合成功能，這8個保守區(qū)域顯示VDl ORF4編碼DNA聚合酶；VD2基因組正鏈含有1個大的開放閱讀框，負鏈含有1個小的開放閱讀框。根據(jù)同源性比較推測該基因組負鏈上開放閱讀框(ORF2)可能編碼非結構蛋白，而正鏈上開放閱讀框(ORFl)

6、可能編碼病毒的結構蛋白。 3.比較BmDNV-3和BffDNV-2(Yamanashi isolate)基因組全序列，兩者VDl的同源性為98.4％，VD2同源性達97.7％，并且有228個堿基的替代、11個堿基的刪除和2個堿基插入。比較這兩個不同株系病毒的開放閱讀框和末端反向重復序列，突變的熱點集中在結構蛋白(VDl ORF3，VD2 ORFl)，VDl ORF4和未端反向重復序列上。本研究中的結論為更好地理解家蠶濃核病毒不同

7、株系差異性及其可能的原因，也為研究家蠶濃核病毒進化提供了有益的線索。 4.在對VDl基因轉錄組織結構研究中，Northern雜交顯示VDl的左邊正鏈上有1.1kb非結構蛋白和1.5kb結構蛋白這兩個轉錄本，右邊的負鏈上有一個3.3kb非結構蛋白轉錄本。3'和5'RACE序列測定結果顯示1.1kb非結構蛋白開始于nt290，結束于nt 1437。ORFl和ORF2完全位于其中，因此有可能通過核糖體掃描機制在不同的閱讀框上翻譯兩種蛋

8、白NSl和NS2。1.5kb結構蛋白開始于nt 1423，結束于nt 2931。編碼結構蛋白的轉錄本(ORF3)和編碼非結構蛋白的轉錄本(ORF4：)在圖距50處擁有10個核苷酸的3'端的共同序列。該病毒的轉錄方式與己報道的其它濃核病毒存在著較大差異。 5.該病毒感染的家蠶中腸組織經(jīng)勻漿、40％(w/w)CsCl2梯度離心和定量PCR，結果顯示VDl和VD2兩者的浮力密度接近相等，約為1.29 g/cm3。該病毒的浮力密度比其它

9、濃核病毒明顯小，再次說明該濃核病毒的特殊性。從不同梯度等份樣品中VDl、VD2的起始拷貝數(shù)判斷，得出它們可能位于各自不同的病毒衣殼蛋白中。另外，SDS-PAGE電泳分析結果顯示BmDNV-3病毒的衣殼蛋白的分子量為48kDa、55kDa、72kDa和97kDa的4條明顯條帶，其中53kDa為主要組分。 6.在原核表達載體中構建了pET28a(+)-VDl ORF4 3'端部分，然后轉化到大腸桿菌BL2 1中。通過IPTG誘導表達