人表皮細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞表型的初步分析.pdf

1、皮膚是人體最大的組織器官，也是始終處于不斷更新?tīng)顟B(tài)的組織之一。皮膚組織這種不斷的更新是由位于表皮基底層以及毛囊隆突部的表皮干細(xì)胞維持的。表皮干細(xì)胞的重要性不僅在于它們?cè)趧?chuàng)傷修復(fù)和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過(guò)程中具有重要作用，而且在于它們是腫瘤發(fā)生的起始細(xì)胞和基因治療的主要靶標(biāo)。因此，表皮干細(xì)胞一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。而如何將表皮干細(xì)胞從皮膚組織中準(zhǔn)確的分離純化、培養(yǎng)和鑒定，是研究表皮干細(xì)胞的最基本條件。但是由于表皮干細(xì)胞數(shù)量較少，且缺乏特異性分子標(biāo)

2、志，分離鑒定存在一定困難。最近研究有一種不依賴細(xì)胞表面標(biāo)志物的干細(xì)胞分離方法——側(cè)群細(xì)胞分離法，正越來(lái)越多地被廣大研究者應(yīng)用。側(cè)群（side population）細(xì)胞又稱SP細(xì)胞，是指一類能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞核的親脂性染料排出胞外的細(xì)胞。該方法最初是在對(duì)造血干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)的，其基本原理就是利用了干細(xì)胞能表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而可以將進(jìn)入胞內(nèi)的DNA結(jié)合熒光染料Hoechst33342主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外這一特異性功能。該SP細(xì)胞群在紫外光激發(fā)下

3、，表現(xiàn)低熒光的特性，可以應(yīng)用流式細(xì)胞儀將其分選出來(lái)。在人多種成體組織，如肝、肺、腦、神經(jīng)、小腸、氣管中都發(fā)現(xiàn)了SP細(xì)胞，該類細(xì)胞群高表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志物，具有干細(xì)胞的特性，富含干細(xì)胞。 目的： 檢測(cè)人表皮細(xì)胞中是否含有SP細(xì)胞，并研究該表型細(xì)胞是否高表達(dá)通用干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2、表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素α6和β1，分析SP細(xì)胞是否是表皮干細(xì)胞，為進(jìn)一步分離和研究表皮干細(xì)胞提供線索和基礎(chǔ)。 方法： 1、表皮單

4、細(xì)胞懸液獲取和細(xì)胞培養(yǎng)：收集86例16～25歲包皮環(huán)切術(shù)患者（無(wú)泌尿系感染）術(shù)后包皮組織。無(wú)菌條件下徹底清洗，去除皮下組織，經(jīng)兩步酶消化法分離獲得表皮單細(xì)胞懸液，接種于鋪有人胎盤(pán)Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶中，用K—SFM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。 2、細(xì)胞染色和SP細(xì)胞分選：取培養(yǎng)的第2～4代表皮細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，一組加入DNA結(jié)合熒光染料Hoechst33342，另一組同時(shí)加入維拉帕米作為對(duì)照，染色后加入碘化丙錠，用流式細(xì)胞儀分選SP細(xì)胞。

5、 3、ABCG2、整合素α6和β1表達(dá)分析：收集分選的SP細(xì)胞，流式細(xì)胞儀和RT—PCR分析通用干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2、表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素α6和β1在SP細(xì)胞中的表達(dá)情況，以同一標(biāo)本總表皮細(xì)胞作為對(duì)照組。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)u檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、表皮細(xì)胞培養(yǎng)24h，可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。5d細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，貼壁細(xì)胞

6、呈多角形，胞漿透亮，胞核較大，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀。7d細(xì)胞大部融合成片。 2、人表皮細(xì)胞中存在SP細(xì)胞，比例為0.2％～0.3％，維拉帕米阻斷后 SP細(xì)胞比例減少（<0.01％）。 3、流式細(xì)胞儀和RT—PCR檢測(cè)到SP細(xì)胞中有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2以及表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物整合素α6和β1。 4、經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2、表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素α6以及整合素β1在SP細(xì)胞中的表達(dá)率和在總表皮

7、細(xì)胞中的表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論： 1、人表皮細(xì)胞中存在SP細(xì)胞，比例為0.2％～0.3％。 2、流式細(xì)胞儀和RT—PCR檢測(cè)到SP細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2以及表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物整合素α6和β1，但與總表皮細(xì)胞比較，這些干細(xì)胞標(biāo)志物在SP細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯增高。 3、 SP細(xì)胞分離法分選到的細(xì)胞可能不是純化的表皮干細(xì)胞，該方法并不能分離高純度的人表皮干細(xì)胞，尚需進(jìn)一步對(duì)表皮干細(xì)