人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中側(cè)群細(xì)胞的分離和特性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)理不明，其占卵巢惡性腫瘤的85-90％，5年生存率約30%左右。通過滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療可使卵巢癌患者的預(yù)后明顯改善，但5年的復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%，且復(fù)發(fā)的卵巢癌往往出現(xiàn)耐藥性而治療效果較差。既往研究顯示腫瘤干細(xì)胞（CSCs）可能是導(dǎo)致如此高復(fù)發(fā)率的一個(gè)潛在原因。機(jī)體干細(xì)胞具有自我更新及多向分化的能力，此外其在正常組織中常處于休眠狀態(tài)，在機(jī)體需要時(shí)重新進(jìn)入細(xì)

2、胞周期增殖替代細(xì)胞或組織修復(fù)。CSCs是指實(shí)體腫瘤內(nèi)部少量具有自我更新能力、能生長出含有異質(zhì)性細(xì)胞群的細(xì)胞。因此對CSCs的研究具有重要意義，分離和鑒定是CSCs研究的第一步，但CSCs缺乏統(tǒng)一的特異性標(biāo)記，故分離和鑒定成為難點(diǎn)，國外部分學(xué)者通過采用流式細(xì)胞分選術(shù)在卵巢癌細(xì)胞中檢測分選出側(cè)群細(xì)胞（SP細(xì)胞）及非側(cè)群細(xì)胞（NSP細(xì)胞），研究其干細(xì)胞屬性，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞能產(chǎn)生SP、NSP子代細(xì)胞，其與NSP細(xì)胞相比具有較強(qiáng)致瘤能力和耐藥性，進(jìn)

3、一步研究發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞高表達(dá)CD44，nestin，ABCG2等具有一定特異性干細(xì)胞分子。
　　雖然規(guī)范化外科手術(shù)聯(lián)合放化療對治療卵巢癌具有較好的效果，但針對腫瘤復(fù)發(fā)及化療不敏感的患者依然需要探索進(jìn)一步的治療方法。故針對腫瘤標(biāo)志物及信號(hào)通路的分子靶向技術(shù)逐漸成為研究熱點(diǎn)。許多研究已證實(shí)各種實(shí)體瘤當(dāng)中存在著腫瘤干細(xì)胞，探索上皮性卵巢癌細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況將對未來的治療研究具有積極意義。
　　方法：
　　將卵巢癌細(xì)

4、胞株SKOV-3培養(yǎng)傳代后，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，經(jīng)Hoechst33342熒光染料處理后使用流式細(xì)胞儀根據(jù)細(xì)胞的不同染色情況區(qū)分出 SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞，并觀察研究順鉑（CDDP）對SP及non-SP細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞活力的影響。
　　具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
　　1，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測SP及non-SP細(xì)胞中CD44蛋白的表達(dá)量。
　　2，采用Real-time PCR方法分析SP及non-SP細(xì)胞中ABCG2和N

5、estin的mRNA表達(dá)情況。
　　3，采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SP及non-SP細(xì)胞體外克隆形成能力。
　　4，分析CDDP對SP及non-SP細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞活力的影響。
　　5，計(jì)量資料用means±SEM（均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤）描述，經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P>0.05時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組結(jié)果均檢驗(yàn)3次
　　結(jié)果：
　　1，CD44標(biāo)記

6、的SP和non-SP細(xì)胞MFI值顯著升高，并且SP細(xì)胞的MFI值更高于non-SP細(xì)胞，提示SP細(xì)胞的CD44抗原表達(dá)更為活躍(P<0.05)。
　　2，SP和non-SP細(xì)胞中ABCG2和Nestin的相關(guān)mRNA的表達(dá)結(jié)果提示分選的SP細(xì)胞中ABCG2和Nestin的表達(dá)顯著高于non-SP細(xì)胞(P<0.05)。
　　3，體外克隆形成能力實(shí)驗(yàn)提示SP細(xì)胞的克隆形成能力遠(yuǎn)強(qiáng)于non-SP細(xì)胞，該結(jié)果提示SP細(xì)胞擁有更活躍的

7、增殖能力。
　　4，CDDP處理試驗(yàn)組中，SP細(xì)胞比non-SP細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞活性，提示SP細(xì)胞對化療藥物具有更強(qiáng)的抗藥性。
　　結(jié)論：
　　腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因（ABCG2和Nestin）的高表達(dá)，均證實(shí)SKOV3細(xì)胞中分離出SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征。分離出的SP細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞克隆形成能力實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出較強(qiáng)的再生和增殖能力。另外，通過觀察順鉑對SP細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞對化