法舒地爾（HA-1077）對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型分化影響的初步研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)具自我復(fù)制及多向分化潛能，能分化為骨、軟骨、脂肪、肌細(xì)胞和各種血細(xì)胞等。同時(shí)，MSCs取材方便，在體外易于分離，培養(yǎng)和擴(kuò)增，因此得到了很多學(xué)者的關(guān)注。進(jìn)一步研究表明<'[3]>，在不同的微環(huán)境下MSCs還可向某些附屬器官分化，如脂肪細(xì)胞、格根包爾式細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和汗腺細(xì)胞等。在體外條件下還有人將成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的上清液和EGF等加入到培養(yǎng)體系中，MSCs出現(xiàn)了表

2、皮細(xì)胞表型角蛋白的表達(dá)。這些研究都表明，MSCs在創(chuàng)傷修復(fù)尤其是皮膚損傷修復(fù)方面具有廣闊的前景和越來(lái)越重要的意義。 MSCs的分化要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控并與靶器官相互作用，信號(hào)平衡的改變可能導(dǎo)致分化結(jié)果的迥然不同，但其具體機(jī)制尚不清楚。小分子GTP酶Rho家族(RhoGTPases)是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的一類(lèi)重要蛋白分子，參與彈性纖維形成、細(xì)胞凋亡及多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)；Rho/ROCK(RHO-dependent protein

3、 kinase)信號(hào)途徑是諸多調(diào)控細(xì)胞增殖的酪氨酸激酶受體信號(hào)通路的樞紐，與細(xì)胞骨架構(gòu)成、極性生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程關(guān)系密切?，F(xiàn)有證據(jù)表明，調(diào)控ROCK活性對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞的分化相當(dāng)重要，ROCK的抑制劑還能夠加速M(fèi)SCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化。2003年Raffaella等<'[4]>研究發(fā)現(xiàn)，Rho/ROCK信號(hào)途徑是決定向脂肪和肌形成過(guò)程中的關(guān)鍵分子開(kāi)關(guān)，并認(rèn)為對(duì)于MSCs的分化可能同樣具有意義。在誘導(dǎo)MSCs向表

4、皮細(xì)胞分化過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)選擇Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑HA-1077(fasudil，法舒地爾)，通過(guò)對(duì)Rho/ROCK信號(hào)途徑的干預(yù)，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞儀等技術(shù)，從細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞表型表達(dá)等方面來(lái)觀(guān)測(cè)其對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(humanmesenchymal stem cells，hMSCs)向表皮細(xì)胞分化的影響。 目的 探討在特定條件下法舒地爾(HA-1077)對(duì)hMSCs向表皮細(xì)胞表型

5、分化的影響。 方法 1、取胎兒股骨骨髓腔抽洗液，F(xiàn)icoll-Paque密度梯度離心法提取、培養(yǎng)并擴(kuò)增hMSCs，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面CD34、CD44表達(dá)。 2、采用兒童新鮮包皮組織帖壁培養(yǎng)纖維細(xì)胞并收集上清液。 3、體外誘導(dǎo)MSCs向表皮細(xì)胞表型分化的實(shí)驗(yàn)分為4組：①對(duì)照組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM)；②誘導(dǎo)組(培養(yǎng)基，采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細(xì)胞上清液+10ng/mlEG

6、F)；③HA-1077誘導(dǎo)組1(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細(xì)胞上清液+10ng/mlEGF+10μmol/L HA-1077)；④HA-1077誘導(dǎo)組2(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細(xì)胞上清液+10ng/mlEGF+30μmol/L HA-1077)。 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定分組誘導(dǎo)2天后hMSCs CK5/8表達(dá)。 5、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定各組hMSCs誘導(dǎo)4天后CK5/8

7、的表達(dá)并觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 6、在誘導(dǎo)7天后測(cè)定各組細(xì)胞CK5/8、CK10/13、CK19表達(dá)和PCNA、P．ERK的陽(yáng)性率及細(xì)胞周期變化。 7、采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多個(gè)樣本均數(shù)比較選用單因素方差分析、兩兩比較選用最小顯著差法。p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、采用Ficoll-Paque密度梯度離心法提取、培養(yǎng)并擴(kuò)增人胚胎股骨MSCs

8、均一性良好，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD34陽(yáng)性率約為0.12％，CD44陽(yáng)性率約為91.53％。 2、分組培養(yǎng)48h后各組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，流式細(xì)胞儀鑒定顯示①對(duì)照組、②誘導(dǎo)組、③HA-1077誘導(dǎo)組、④HA-1077誘導(dǎo)組<,2>CK5/8陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.23±0.05％、0.95±0.09％、1.14±0.11％、2.46±0.49％，呈上升趨勢(shì)。誘導(dǎo)前后即MSCs①和②③④組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05，p<0.

9、01，p<0.01)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，MSCs②③④中角蛋白陽(yáng)性表達(dá)逐漸提高。 3、誘導(dǎo)后4天免疫細(xì)胞化學(xué)顯示：各誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)仍無(wú)明顯變化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn)MSCs①無(wú)CK5/8的表達(dá)，余各組均呈現(xiàn)不同程度的CK5/8的表達(dá)，以MSCs③④培養(yǎng)基誘導(dǎo)的表達(dá)最多。和第2天流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果一致。 4、誘導(dǎo)7天后流式細(xì)胞儀測(cè)定表明，MSCs①②③④四組中CK5/8、CK10/13、CK19的陽(yáng)性表達(dá)率(見(jiàn)表1)均明顯呈上

10、升趨勢(shì)，在三種角蛋白的比較中：HA-1077作用前、后即MSCs②組與③或④組比較差異均顯著(p<0.01，p<0/01)，單純誘導(dǎo)前、后即MSCs①與②組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 5、流式細(xì)胞儀顯示誘導(dǎo)7天后單純誘導(dǎo)組即MSCs②組與HA-1077作用組即MSCs③中PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率均高于(9.78±3.33％，10.72±1.05％；p<0.01，p<0.01)對(duì)照組MSCs①(3.31±0.76％)。同時(shí)

11、，細(xì)胞周期表明在MSCs①②③組中處于G0/G1期的細(xì)胞逐漸減少，處于S期的比例上升；其中單純誘導(dǎo)前、后即MSCs①與②組比較(p<0.05)，HA-1077作用前、后即MSCs②組與③組比較(p<0.01)差異顯著。 6、誘導(dǎo)7天后流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示HA-1077作用前、后即MSCs②組與③組之間的P-ERK陽(yáng)性表達(dá)率比較差異顯著(p<0.01)。 結(jié)論 1、采用密度梯度離心法可得到成份均一、純度高的hMSC