SGC7901-DDP細(xì)胞MDR1、LRP、MRP1、RhoE和ERCC1基因表達(dá)及其耐藥特性的研究.pdf

1、目的:胃癌在我國(guó)是最常見的腫瘤之一,手術(shù)切除是目前胃癌的主要治療手段。由于沒有開展胃癌篩查,許多患者確診時(shí)就已處于晚期而無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療。因而化療顯得尤為重要,化療不僅能夠改善患者的預(yù)后,還能提高患者的生活質(zhì)量。順鉑(cisplatin,DDP)是胃癌化療中最基礎(chǔ)的藥物,NCCN治療指南指出以DDP為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是胃癌化療首選方案。然而胃癌的總體預(yù)后不佳,化療的有效率大多在5～50％之間,其主要原因是腫瘤原發(fā)或繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生,致使腫

2、瘤對(duì)化療不敏感,最終導(dǎo)致治療失敗出現(xiàn)進(jìn)展。雖然對(duì)于順鉑耐藥的研究揭示了眾多的機(jī)制,但是隨著胃癌SGC7901順鉑耐藥細(xì)胞株(SGC7901/DDP)的建立,對(duì)于胃癌細(xì)胞DDP耐藥的研究也逐步開始。腫瘤耐藥是一個(gè)多基因、多因素綜合作用的復(fù)雜過程。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物形成耐藥的過程中常常也伴隨著對(duì)其它不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥,因此尋找和篩選參與順鉑耐藥的基因?qū)⒂兄谶M(jìn)一步對(duì)胃癌獲得性耐藥的機(jī)制的研究。目前、P-糖蛋白(P-

3、gp)、肺耐藥蛋白(LRP)、多藥耐藥蛋白1(MRP1)在胃癌多藥耐藥機(jī)制中研究較多,它們主要通過將化療藥物排出細(xì)胞外或改變藥物的胞內(nèi)分布參與腫瘤的多藥耐藥。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)作為NER途徑中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),它能夠快速修復(fù)受損DNA來介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥。同時(shí),近年來研究發(fā)現(xiàn)Ras家族蛋白R(shí)hoE也參與腫瘤的耐藥形成。本研究通過對(duì)胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞株及其親代SGC7901細(xì)胞株的耐藥特性進(jìn)行研究,觀察

4、其在獲得順鉑耐藥過程中對(duì)其他抗腫瘤藥物敏感性的改變,同時(shí)檢測(cè)耐藥相關(guān)基因MDR1、LRP、MRP1、RhoE及ERCC1mRNA及其蛋白在兩細(xì)胞株中表達(dá)的改變,初步探討胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞的耐藥特性及可能的機(jī)制,為胃癌的順鉑耐藥逆轉(zhuǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:我們采用MTT比色法檢測(cè)SGC7901/DDP及SGC7901細(xì)胞對(duì)胃癌化療常用的藥物順鉑(DDP)、紫杉醇(PTX)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADR)

5、進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及蛋白質(zhì)印記(Western blot)的方法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP和親代細(xì)胞株SGC7901的MDR1/P-gP、LRP、MRP1、RhoE和ERCC1的表達(dá)異同,初步探討胃癌耐藥機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1)SGC7901/DDP及SGC7901細(xì)胞株對(duì)化療藥物DDP、PTX、5-FU、ADR的敏感性:
　　

6、 SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)DDP、PTX、5-FU、ADR的IC50分別為:11.245±0.272mg/L、3.277±0.426mg/L、12.154±2.036mg/L、0.763±0.043mg/L,SGC7901細(xì)胞對(duì)DDP、PTX、5-FU、ADR的IC50分別為:2.206±0.256mg/L、1.528±0.097 mg/L、4.481±0.544mg/L、0.229±0.020mg/L,其耐藥指數(shù)分別為:5.08

7、、2.14、2.71、3.33,SGC7901/DDP對(duì)四種藥物的敏感性顯著低于SGC7901細(xì)胞(P＜0.05)。
　　 2)提取RNA的質(zhì)量檢測(cè)
　　 從胃癌SGC7901/DDP及SGC7901細(xì)胞中提取的RNA的濃度分別為:936.12 mg/L和875.29 mg/L,A260/A280值均在1.9～2之間,甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:其18S和28S條帶清晰,亮度比約為1:2,表明總RNA純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求

8、且無(wú)明顯降解,可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 3)RT-PCR法檢測(cè)MDR1、LRP、MRP1、RhoE和ERCC1的mRNA表達(dá)
　　 MDR1、LRP、MRP1、RhoE和ERCC1 mRNA在SGC7901細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.050±0.017、0.689±0.038、0.595±0.064、0.616±0.050、0.410±0.061;在SGC7901/DDP細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.128±0.03

9、9、0.938±0.041、O.655±0.056、O.591±0.076、0.462±0.042。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,MDR1、LRP mRNA在SGC7901/DDP細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于SGC7901細(xì)胞(P＜0.05);而MRP1、RhoE和ERCC1 mRNA在兩種細(xì)胞株中的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 4)MDR1、LRP、MRP1、RhoE和ERCC1的蛋白表達(dá)
　　 MDR1、LRP、MRP1、RhoE

10、和ERCC1在SGC7901細(xì)胞中蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.032±0.096、0.409±0.043、0.144±0.037、0.366±0.056、0.268±0.037,而SGC7901/DDP細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.118±0.020、0.792±0.075、0.344±0.037、0.651±0.062、0.495±0.053。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,五種蛋白在兩細(xì)胞株中表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.05),MDR1、LRP、MR

11、P1、RhoE和ERCC1在SGC7901/DDP細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平顯著高于SGC7901細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1)胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)紫杉醇、5-氟脲嘧啶、阿霉素具有交叉耐藥性,呈現(xiàn)出多藥耐藥特性。
　　 2)MDR1和LRP mRNA及其編碼蛋白在胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞中的表達(dá)均高于SGC7901細(xì)胞,MDR1/P-gP和LRP表達(dá)改變可能是胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐