酶解麥麩制備阿魏酰低聚糖及其生物活性的研究.pdf

1、大量流行病學(xué)研究結(jié)果表明谷物中的酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)慢性疾病的預(yù)防起著關(guān)鍵性的作用。阿魏酸是谷物中含量最豐富的酚酸，它通過(guò)酯鍵與細(xì)胞壁中阿拉伯木聚糖側(cè)鏈上的一些阿拉伯糖殘基相連，以結(jié)合態(tài)的形式存在。小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，是人類(lèi)膳食的重要組成部分。小麥麩皮細(xì)胞壁多糖經(jīng)適度的酸或多糖水解酶處理可以獲得阿魏酰低聚糖(FOs)。FOs具有卓越的生物活性，能夠有效地抑制脂蛋白的過(guò)氧化，在阻止或減緩動(dòng)脈硬化進(jìn)程等方面可能具有重要意義。到目前為止

2、，有關(guān)阿魏酰低聚糖方面的研究，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有報(bào)道。因此，本研究利用Bacillussubtilis木聚糖酶水解麥麩不溶性膳食纖維制備FOs，并對(duì)其生物活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)一步應(yīng)用量子化學(xué)計(jì)算表征FOs的一些理論參數(shù)(如酚O-H的解離能和疏水參數(shù))，從理論上闡述FOs的構(gòu)效關(guān)系。 選擇濃度為100mg/mL的分離膠，375mmol/LpH9.0Tris/鹽酸分離膠緩沖液，50mmol/LTris/384mmol/L甘氨酸(pH8.3)電極

3、緩沖液的電泳體系，分離B.subtilis木聚糖酶可以獲得良好的分辨率。采用NativePAGE和均質(zhì)提取法相結(jié)合從B.subtilis木聚糖酶中分離純化了兩種內(nèi)切木聚糖酶，將它們分別定義為xylⅠ和xylⅡ，它們的比活力分別為193.2和472.1U/mg蛋白質(zhì)。由此說(shuō)明這種以NativePAGE和均質(zhì)提取相結(jié)合的分離純化內(nèi)切木聚糖酶的方法能夠很好地保持酶的生物活性，具有快速、簡(jiǎn)便和高效等優(yōu)點(diǎn)。 內(nèi)切木聚糖酶xylⅠ和xylⅡ

4、具有相同的最適反應(yīng)溫度(50℃)和最適pH(7.0)。Mn2+對(duì)酶反應(yīng)具有促進(jìn)作用，將酶活提高了2.7倍，而Fe3+對(duì)酶反應(yīng)起完全抑制作用。SDS-PAGE分析結(jié)果表明內(nèi)切木聚糖酶xylⅠ的分子質(zhì)量約為53.0kDa，xylⅡ的分子質(zhì)量約為98.8kDa。以樺木木聚糖為底物，內(nèi)切木聚糖酶xylⅠ的Km=1.11mg/mL，Vmax=0.22mgmL-1min-1，xylH的Km=3.07mg/mL，Vmax=0.57mgmL-1min-

5、1。 利用耐高溫α-淀粉酶、水解蛋白酶和精制糖化酶處理小麥麩皮樣品得到不溶性膳食纖維，得率在40％左右，其中戊聚糖含量約占54.7％，阿魏酸約占0.90％。B.subtilis木聚糖酶水解麥麩不溶性膳食纖維能夠釋放出FOs。采用一種5水平，5因子的中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了制備FOs的酶解生物過(guò)程，得到FOs濃度最大時(shí)酶解反應(yīng)條件，即：反應(yīng)溫度42℃，pH5.2，反應(yīng)時(shí)間35h，酶量4.8g/L，底物濃度120g/L。 FO

6、s用AmberliteXAD、SephadexLH20進(jìn)行純化，高效液相色譜(HPLC)和高效陰離子交換色譜—脈沖安培檢測(cè)器(HPAEC-PAD)分析結(jié)果揭示FOs由酯化的阿魏酸、阿拉伯糖和木糖所組成。紫外光譜分析表明FOs的MOPS緩沖液在325nm處有最大吸收值。紅外光譜分析表明FOs在990cm-1處有一低強(qiáng)度的肩峰，說(shuō)明阿拉伯糖基的存在，并且與吡喃型木糖O-3位相連；在1731cm-1處有酯鍵的特征吸收峰。首次采用在線(xiàn)高效液相色

7、譜與電噴霧多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MSn)對(duì)FOs進(jìn)行分析，推測(cè)FOs中兩個(gè)主要化合物的結(jié)構(gòu)為O-木糖基-[5-O-(阿魏酰基)-α-阿拉伯糖基-(1→3)]-木糖基-(1→4)-β-木糖和O-木糖基-[5-O-(阿魏?；?-α-阿拉伯糖基-(1→3)]-木糖基-(1→4)-β-木糖基-(1→4)-β-木糖。 BifidobacteriumbifidumF-35在以5.0mg/mLFOs作碳源的TPY培養(yǎng)基嚴(yán)格厭

8、氧培養(yǎng)時(shí)，菌株具有產(chǎn)酸的能力，由此表明該菌株能夠利用FOs作為碳源。但該菌株不能利用阿拉伯糖和木糖。當(dāng)FOs添加到TPY培養(yǎng)基中，B.bifidumF-35的生物量隨FOs濃度的增加而增大。與純TPY培養(yǎng)基相比，B.bifidumF-35在含有1.0mg/mLFOs的TPY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最大生物量提高了50％。這些結(jié)果表明FOs能夠體外促進(jìn)B.bifidumF-35的生長(zhǎng)。 FOs對(duì)Fe2+具有明顯的螯合作用，呈劑量依賴(lài)關(guān)系；F

9、Os具有非常明顯的*OH自由基清除能力，它的ECs0值只有甘露醇ECs0值的44.7％；FOs對(duì)DPPH*具有強(qiáng)烈的清除作用，濃度為10.0mg/mL時(shí)，其清除能力達(dá)到84.5％，可以與合成抗氧化劑BHT相媲美；AAPH誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞氧化性溶血具有劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，而FOs能夠抑制AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化性溶血，當(dāng)FOs濃度達(dá)到4.0mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到了90％以上，并使紅細(xì)胞氧化性溶血被抑制在120min以上。以上結(jié)果表明FOs

10、是一種有效的天然抗氧化劑，能夠保護(hù)生物膜免受自由基誘導(dǎo)的氧化性損傷。 FOs能夠明顯地抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)，抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)關(guān)系，當(dāng)FOs的濃度達(dá)到1.0mg/mL，糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的熒光淬滅了64％，說(shuō)明FOs也是一種有效的蛋白質(zhì)糖基化抑制劑。FOs能夠抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)，阻止了AGEs的形成，可能與其阿魏?；糠钟嘘P(guān)。 應(yīng)用量子化學(xué)計(jì)算了FOs分子結(jié)構(gòu)中酚O-H的△HOF及其LogP，結(jié)果表明

11、FOs與阿魏酸相比，其△HOF值略低一些，而FOs隨著糖體聚合度的增大，logP值減小非常明顯。從理論上證實(shí)了FOs分子中的阿魏?；ㄟ^(guò)抽氫反應(yīng)產(chǎn)生的苯氧自由基比較穩(wěn)定，甚或比游離的阿魏酸通過(guò)抽氫反應(yīng)產(chǎn)生的苯氧自由要更穩(wěn)定一些，F(xiàn)Os的親水性比游離阿魏酸要強(qiáng)得多。 AAPH誘導(dǎo)人血紅細(xì)胞溶血呈現(xiàn)典型時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，經(jīng)過(guò)一定的抑制期(tlag(AH)=130min)后，紅細(xì)胞出現(xiàn)快速溶血；抑制期過(guò)后再加入FOs，又產(chǎn)生了一個(gè)新的抑制

12、期(tlag(FOs)=50min)。紅細(xì)胞懸浮液中加入FOs后，紅細(xì)胞的固有抑制期會(huì)明顯增加(tlag(FOs+AH)=260min)。加入FOs的紅細(xì)胞產(chǎn)生的抑制期比天然紅細(xì)胞產(chǎn)生的抑制期與FOs單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的抑制期的加合要長(zhǎng)，說(shuō)明FOs與紅細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑(AH)顯示出了協(xié)同作用，協(xié)同效率達(dá)到44.4％。在AAPH誘導(dǎo)人血紅細(xì)胞氧化傷害過(guò)程中，紅細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)損耗較快，脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)生成增多，膜蛋白質(zhì)發(fā)生氧