Twist基因RT-PCR方法的建立和PAB-Gal4-DBD-HA-twist重組質(zhì)粒的制備.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分、Twist基因RT-PCR方法的建立 目的：Twist是胚胎發(fā)育相關(guān)基因，編碼一種在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，在誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)及組織塑型中起重要作用。新近發(fā)現(xiàn)twist具有癌基因的特征，在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、愈后、復(fù)發(fā)中具有重要作用，在人類多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在正常組織和惡性程度低的癌細(xì)胞中無或極低表達(dá)。Twist—因GC含量高（75%），局部區(qū)域GC含量高達(dá)90％以上，有連續(xù)的

2、30個(gè)GC（NM—000474），具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription polymerase chain，RT—PCR）方法的建立是一項(xiàng)相當(dāng)困難而又費(fèi)力費(fèi)時(shí)的工作。本課題以腎癌細(xì)胞系786—0、肝癌細(xì)胞系HepG2、胃癌細(xì)胞系MNK和人正常乳腺細(xì)胞系Hs578Bst為研究對(duì)象，建立twist基因的RT—PCR方法，為探討twist在腫瘤尤其在腎癌中的作用機(jī)制奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 方法

3、：蘇復(fù)液氮凍存的腎、肝、胃癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞株，加入RPMI1640液培養(yǎng)（含10%的小牛血清），置于CO2培養(yǎng)箱中（5%CO2、95%空氣、37℃）培養(yǎng)，24h更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d更換一次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)傳代或提取RNA。用RNA simple Total RNA kit提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度計(jì)定量檢測(cè)濃度、純度。cDNA合成按照Qu

4、antscript RT kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作合成。PCR擴(kuò)增所用引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank中的TW/ST（NM_000474）基因序列，運(yùn)用Primer5.0引物軟件并結(jié)合Olig06.0的評(píng)價(jià)分析，最后經(jīng)Blast檢索以確保每條引物與基因庫人類已知的其它基因無同源性，同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參照基因并設(shè)計(jì)其引物。PCR擴(kuò)增操作按照TAKARA公司的LA Taq with GC Buffer PCR試劑

5、盒說明書，設(shè)置PCR反應(yīng)體系并優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)條件，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，照相保存。 結(jié)果：（1）總RNA的質(zhì)量：提取的總RNA通過紫外分光光度計(jì)測(cè)量，A260/A280在1.80～2.10之間，A260/A2301.90～2.20之間，濃度大于300 ng/μl，通過1%瓊脂糖凝膠電泳后，28S帶比18S帶明顯，灰度比大于1，無拖尾；（2）采用TAKARA的LA Taq with GC buffer PCR試劑盒，通

6、過PCR方案的優(yōu)化，在腎癌細(xì)胞系786—0、肝癌細(xì)胞系HepG2和胃癌細(xì)胞系MNK中均擴(kuò)增出twist基因的特異表達(dá)帶。 結(jié)論：（1）成功摸索出了具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)、富含GC的twist基因的RT—PCR擴(kuò)增方法；（2）RT—PCR結(jié)果顯示在腎癌細(xì)胞系中存在twist基因的特異表達(dá)。 第二部分、PAB-Gal4-DBD-HA-Twist重組質(zhì)粒的制備 目的：TWIST蛋白是一種在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，

7、屬于堿性的螺旋一環(huán)一螺旋（bHLH）蛋白家族成員，在不同的種屬之間其核苷酸和氨基酸序列高度保守，其能與DNA上E—BOX的5’—CANNTG—3’序列結(jié)合并且能借助HLH形成特定的同源或異源二聚體，廣泛參與調(diào)控器官生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖分化等過程，并賦予細(xì)胞遷移的能力，還能介導(dǎo)上皮細(xì)胞一間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)變（Epithelial—Mesenchymal transition，EMT）及細(xì)胞的遷移，是上皮間質(zhì)變過程中的重要調(diào)控因子。本實(shí)驗(yàn)

8、擬采用PCR和分子克隆技術(shù)，構(gòu)建人Twist基因的表達(dá)載體pAB—Ga14—DBD—HA—Twist，為進(jìn)一步研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)工具。 方法：（1）設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ的特異引物，對(duì)重組克隆質(zhì)粒pcDNA—Flag—Twist進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有酶切位點(diǎn)的Twist基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列：（2）對(duì)含有酶切位點(diǎn)的Twist基因全長(zhǎng)片段和pAB—Ga14—DBD—HA表達(dá)載體進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切

9、反應(yīng)，電泳分離，膠回收純化后，進(jìn)行連接反應(yīng)；（3）將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中，過夜培養(yǎng)；（4）菌落PCR，提取陽性重組質(zhì)粒作限制性內(nèi)切酶分析和序列測(cè)定。 結(jié)果：（1）限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒中含有與Twist基因編碼區(qū)全長(zhǎng)一致的650 bp片段；（2）DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析顯示：與GenBank數(shù)據(jù)庫twist基因（NM_000474）序列完全一致，同源性為100%。 結(jié)論：成功構(gòu)建了