大鼠邊緣下區(qū)在條件性恐懼記憶消退保持中的作用機制研究.pdf

1、隨著突發(fā)性災(zāi)難事件的增多，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumaticstressdisorder，PTSD）成為全球關(guān)注的熱點。PTSD的本質(zhì)是一系列與創(chuàng)傷事件相關(guān)的記憶（條件性恐懼），創(chuàng)傷性記憶一旦形成，很難自然消失，嚴(yán)重影響日常生活。暴露療法的原理是創(chuàng)傷記憶的消退，但其對PTSD的療效難以維持，表現(xiàn)為已消退的恐懼記憶又很快再現(xiàn)。提示消退保持（extinctionretention）障礙可能是創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)生和治療困難的關(guān)鍵。既往

2、實驗表明內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medialprefrontalcortex，mPFC）邊緣下區(qū)（infralimbicarea，IL）與PTSD發(fā)生、發(fā)展和治療結(jié)局密切相關(guān)，然而，其在條件性恐懼消退保持中的作用和機制尚不清楚。
　　我們在以往學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，綜合行為藥理學(xué)、形態(tài)學(xué)以及WesternBlot方法探索條件性恐懼記憶消退的最佳“時間窗”，探討IL區(qū)在條件性恐懼記憶消退保持中的作用及其機制，為提高并鞏固PTSD治療效果提供實驗

3、依據(jù)。為達(dá)成這一目的，設(shè)計了以下3個實驗。
　　實驗一：不同消退方式后條件性恐懼大鼠消退保持的動態(tài)觀察
　　目的：探討條件性恐懼大鼠經(jīng)歷不同消退訓(xùn)練后，消退記憶保持水平的動態(tài)變化。
　　方法：條件刺激（聲音）與非條件刺激（不可逃避的足底電擊）配對呈現(xiàn)建立條件性恐懼；隨后重復(fù)呈現(xiàn)單獨的條件刺激用于消退訓(xùn)練。48只SD雄性大鼠隨機分為3組：對照組（自然消退，Cont組），大鼠建立聲音提示的條件性恐懼而不進(jìn)行消退訓(xùn)練；立即消

4、退組（ImmeEXT），建立條件性恐懼后15min進(jìn)行消退訓(xùn)練；延遲消退組（EXT組），建立條件性恐懼后24h進(jìn)行消退訓(xùn)練。以上三組大鼠一半于建模后第1、3、7、20天測試僵立行為（大鼠連續(xù)10min內(nèi)僵立時間百分比）；另一半分別于消退后第1、3、7、20天通過高架十字迷宮測試焦慮行為。
　　結(jié)果：Cont①，ImmeEXT和EXT組僵立行為基礎(chǔ)值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。EXT組的消退效果好于ImmeEXT和Cont組

5、(P<0.001)，其遠(yuǎn)期消退效果持續(xù)穩(wěn)定；EXT組大鼠消退后第1、3天的僵立行為顯著下降(P<0.01)，第7天已接近正常水平。ImmeEXT組和Cont組間消退效果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠在消退后7-20天僵立行為的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　②，ImmeEXT和EXT組的開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OAtime％）和開放臂停留時間百分比（OAtime％）基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；在消退

6、后不同時間點，OAentries％和OAtime％兩個指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?？傮w來說，各組動物隨實驗天數(shù)延長其焦慮水平逐漸降低，但各組之間在同一時間點上的焦慮水平的改變無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Cont
　　結(jié)論：不同的消退訓(xùn)練方式對條件性恐懼大鼠的遠(yuǎn)期消退效果不同，延遲消退訓(xùn)練方式效果最好。同時，由于不同處理組大鼠的焦慮水平類似，排除了立即消退組僵立評分值較高是焦慮水平升高所致。
　　實驗二：條件性

7、恐懼消退保持過程中IL區(qū)磷酸化CREB的動態(tài)變化
　　目的：探討條件性恐懼大鼠經(jīng)歷不同消退訓(xùn)練后，消退記憶保持過程中，IL區(qū)pCREB的變化。
　　方法：實驗一觀察到條件性恐懼延遲消退訓(xùn)練效果好于立即消退訓(xùn)練，且消退后1-3天的消退效果最為明顯。本實驗采用聲音-足底電擊配對（條件恐懼）或非配對（非條件恐懼）刺激后，使用延遲消退方式訓(xùn)練大鼠，比較非條件恐懼和條件恐懼延遲消退后大鼠僵立行為變化和IL區(qū)pCREB的表達(dá)不同，同時觀

8、察條件恐懼延遲消退組在消退后1、3、7天IL區(qū)信號分子pCREB的動態(tài)變化。將SD雄性成年大鼠隨機分為5組：空白組（Naive組，無任何處理），假訓(xùn)練A組（ShamA，聲音和足底電刺激不配對呈現(xiàn)），假訓(xùn)練B組（ShamB，僅有足底電刺激），條件性恐懼組（Cont組，無消退訓(xùn)練），延遲消退組（EXT組）。除Cont組外，其余各組均采用與實驗一相同的延遲消退訓(xùn)練方式，在消退后24h取材；EXT組在延遲消退后不同時間點（消退后1、3、7天）取

9、材；各組均采用免疫熒光染色及WesternBlot定位和半定量檢測目標(biāo)蛋白pCREB的表達(dá)水平（3-4只大鼠/時間點）。免疫熒光單一標(biāo)記各組IL區(qū)pCREB以說明非條件恐懼對IL區(qū)細(xì)胞pCREB表達(dá)的影響。免疫熒光三重標(biāo)記分別指：pCREB顯示細(xì)胞核（綠），Neu-N顯示神經(jīng)元胞體和胞核（紅），hoechst染色細(xì)胞核（藍(lán)）。pCREB陽性細(xì)胞同時為Neu-N陽性、hoechst陽性的進(jìn)行記數(shù)。以此說明延遲消退后IL區(qū)神經(jīng)元的pCREB

10、表達(dá)水平。
　　結(jié)果：EXT①組消退后1天僵立時間百分比（48.72±10.27）顯著低于ShamA（79.65±6.88）、ShamB（77.53±6.03）和Cont組（61.12±10.22）(P<0.001)，而明顯高于Naive組（55.77±10.40）（P<0.01）。EXT組消退后1天（823.70±67.31）IL區(qū)pCREB陽性細(xì)胞表達(dá)顯著高于ShamA（442.20±53.19），ShamB（453.20±4

11、9.47）和Cont組（564.20±55.37）（P<0.001），而低于Naive組（994.00±56.62）pCREB表達(dá)（P<0.01）。ShamA組和ShamB組的僵立時間百分比和IL區(qū)pCREB陽性細(xì)胞表達(dá)與Cont組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　?、诿庖邿晒馊貥?biāo)記IL區(qū)pCREB陽性神經(jīng)元表達(dá)數(shù)：在延遲消退后1天（45±5.70）、3天（62±8.39）、7天（66.2±7.59）大鼠IL區(qū)pCREB

12、陽性表達(dá)數(shù)呈逐漸增加趨勢，其中在消退后第1、3天增加迅速（P<0.001），消退后3、7天的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），消退后第7天基本回復(fù)到正常水平。條件性恐懼組IL區(qū)pCREB陽性表達(dá)數(shù)（28±2.73）顯著低于Naive組（73.2±5.31）和延遲消退組在各時間點的表達(dá)數(shù)（P<0.001）。
　　WesternBlot③結(jié)果：將β-actin表達(dá)強度作為內(nèi)參，各組大鼠IL區(qū)pCREB目標(biāo)蛋白表達(dá)變化如下：延遲消退組在

13、消退后1天（0.86±0.06）、3天（1.11±0.06）、7天（1.22±0.04）的pCREB蛋白表達(dá)量持續(xù)增加（P<0.01），消退后1、3天增加尤為突出。條件性恐懼組大鼠pCREB蛋白表達(dá)顯著減少到（0.54±0.03）（P<0.001）。消退后7天的目標(biāo)蛋白表達(dá)與Naive組（1.39±0.05）的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：聲音提示的條件性恐懼伴隨IL區(qū)內(nèi)pCREB表達(dá)水平降低，而僵立行為的改善伴隨

14、IL區(qū)pCREB表達(dá)水平的逐漸增強。延遲消退后第1-3天IL區(qū)內(nèi)pCREB的表達(dá)水平顯著升高，且這些表達(dá)變化主要集中在IL區(qū)神經(jīng)元內(nèi)。提示pCREB可能參與條件恐懼的消退。
　　實驗三：NMDA受體在大鼠條件性恐懼消退保持中的作用機制研究
　　目的：觀察非競爭性NMDA受體拮抗劑MK-801對條件性恐懼大鼠消退保持及IL區(qū)pCREB表達(dá)的影響，探討NMDA受體影響消退保持的可能機制。
　　方法：采用延遲消退訓(xùn)練方法，將

15、雄性成年SD大鼠隨機分為4組。訓(xùn)練前腹腔注射MK-801（Pre-MK-801）組：延遲消退訓(xùn)練前40min腹腔注射MK-801（0.3mg/kg）；訓(xùn)練后腹腔注射MK-801（Post-MK-801）組：延遲消退訓(xùn)練后4h腹腔注射MK-801（0.3mg/kg）；延遲消退組（EXT）：條件性恐懼建立24h后進(jìn)行消退訓(xùn)練，給予等量生理鹽水；對照組(自然消退，Cont)：只建立條件性恐懼，不進(jìn)行消退訓(xùn)練，給予等量生理鹽水。一半大鼠于消退當(dāng)

16、日（EXT-0d）、消退后1、3、7（EXT-1、3、7d）測定僵立時間，進(jìn)行條件性恐懼消退保持研究；另一半大鼠在上述時間點進(jìn)行高架十字迷宮實驗，以評價實驗處理后大鼠在消退期間焦慮水平的變化。同樣處理的大鼠在相同的時間點被處死，用于免疫熒光、WesternBlot研究（3-4只大鼠/時間點）。免疫熒光三重標(biāo)記分別指：pCREB顯示細(xì)胞核（綠），Neu-N顯示神經(jīng)元胞體和胞核（紅），hoechst染色細(xì)胞核（藍(lán)）。pCREB陽性細(xì)胞同時為

17、Neu-N陽性、hoechst陽性的進(jìn)行記數(shù)。以此說明延遲消退后IL區(qū)pCREB神經(jīng)元表達(dá)的水平。
　　結(jié)果：①各組大鼠僵立行為基礎(chǔ)值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Post-MK-801組大鼠在EXT-1、3、7天的僵立行為高于EXT組的相同時間點（P<0.01），但明顯低于Pre-MK-801組和對照組（P<0.05）。Pre-MK-801組在EXT-1、3、7天的僵立行為與對照組相同時間點比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）

18、。Cont組在EXT-7d的僵立行為低于EXT-0d（P<0.05）。在消退后各時間點上Pre-MK-801組和Post-MK-801組的僵立行為改變無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　?、诟鹘M大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)百分?jǐn)?shù)（OAentries％）和開放臂停留時間百分?jǐn)?shù)(OAtime％)基礎(chǔ)值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在消退后不同時間點，OAentries％和OAtime％兩個指標(biāo)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠焦慮

19、水平隨實驗天數(shù)延長有所改善，但各組之間在同一時間點上的焦慮水平的改變無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　?、勖庖邿晒馊貥?biāo)記IL區(qū)pCREB的神經(jīng)元數(shù)表達(dá)：Post-MK-801組（42.80±4.32）IL區(qū)pCREB陽性神經(jīng)元數(shù)低于EXT組（48.80±2.39）（P<0.05），但明顯高于Pre-MK-801組（34.80±3.11）和對照組（35.60±4.16）（P<0.01）。Pre-MK-801組IL區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)與對照

20、組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　WesternBlot④結(jié)果顯示：將β-actin表達(dá)強度作為內(nèi)參，不同給藥方式大鼠IL區(qū)pCREB目標(biāo)蛋白表達(dá)變化如下：Post-MK-801組（0.71±0.06）IL區(qū)pCREB陽性帶明顯低于EXT組（0.87±0.08）（P<0.01），但明顯高于Pre-MK-801組（0.49±0.05）和對照組（0.52±0.03）（P<0.01）。Pre-MK-801組IL區(qū)pCREB陽性帶

21、與對照組比較其差異無統(tǒng)計學(xué)意義性（P>0.05）。
　　結(jié)論：在消退訓(xùn)練前40min、消退訓(xùn)練后4h腹腔注射MK-801不影響大鼠的焦慮行為，而影響其條件恐懼消退的鞏固和保持。消退訓(xùn)練前40min腹腔注射MK-801的消退效果明顯差于消退訓(xùn)練后4h給藥，這些行為學(xué)改變伴隨IL區(qū)pCREB神經(jīng)元表達(dá)水平的相應(yīng)改變。大鼠IL區(qū)的pCREB可能參與了條件性恐懼記憶的建立和消退過程，MK-801可能通過拮抗NMDA受體從而減弱大鼠條件性恐