妊娠其婦女甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)的動(dòng)態(tài)變化及TPOAb升高動(dòng)物模型的建立.pdf

1、第一部分 妊娠期甲狀腺過氧化物酶抗體動(dòng)態(tài)變化及其亞類分析
　　背景：
　　甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)是一種糖基化血紅素蛋白，是甲狀腺激素合成的關(guān)鍵酶，參與甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)分子上酪氨酸殘基的碘化與碘化酪氨酸的偶聯(lián)。TPO是微粒體抗原的主要成分，是甲狀腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）的器官特異性自身抗原。
　　甲狀腺過氧化物

2、酶抗體(TPOAb)舊稱甲狀腺微粒體抗體，血清中TPOAb是多克隆IgG類抗體，可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四個(gè)亞類。其中以IgG1、IgG4亞類抗體為主。它們中大部分可作用于TPO分子上的免疫優(yōu)勢區(qū)(IDR)。其中IgG1、IgG2、IgG3亞類可激活經(jīng)典的補(bǔ)體途徑(CDC效應(yīng))和介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，Ig

3、G4亞類可阻斷補(bǔ)體的活化。有報(bào)告指出，在橋本甲狀腺炎(Hashimoto thyroiditis，HT)患者中TPOAb陽性者幾乎占100％，而甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）陽性者占80％。在甲狀腺功能正常的人群中TPOAb陽性率可達(dá)12％-26％。世界范圍內(nèi)妊娠婦女TPOAb陽性率為2.8％-19.6％。近十余年來，TPOAb陽性婦女妊娠與妊娠不良結(jié)局之間的關(guān)系逐漸得到了人們的認(rèn)識(shí)和關(guān)注。TPOAb陽性婦女妊娠與流產(chǎn)、早產(chǎn)等妊娠不良結(jié)局

4、及不孕之間相關(guān)。
　　近幾年的臨床研究提示，給予TPOAb陽性妊娠婦女左甲狀腺素(L-T4)、硒干預(yù)等可以改善妊娠不良結(jié)局，但研究結(jié)果并不十分一致。因此，本研究通過大型的臨床多中心妊娠早期亞臨床甲狀腺功能減退篩查及隨訪項(xiàng)目（SHEP項(xiàng)目）募集TPOAb陽性的妊娠早期婦女，給予其L-T450微克/天干預(yù)，觀察整個(gè)妊娠過程中TPOAb的動(dòng)態(tài)變化，以及L-T4干預(yù)對(duì)TPOAb滴度的影響。同時(shí)探討TPOAb與甲功、鐵營養(yǎng)狀態(tài)之間的關(guān)系。另

5、外，我們擬應(yīng)用SHEP項(xiàng)目中TPOAb陽性妊娠婦女隨訪獲得的分娩時(shí)點(diǎn)的母血與新生兒臍帶血(14對(duì))，分析TPOAb各IgG亞類通過胎盤的能力。
　　方法：
　　從4206名妊娠小于8周的婦女中篩選出123名TPOAb陽性及656名TPOAb陰性甲功正常的志愿婦女作為研究對(duì)象。測量促甲狀腺素(TSH)、游離甲狀腺素(FT4)、TPOAb、血清鐵蛋白(SF)等。將研究對(duì)象分為TPOAb陽性L-T4干預(yù)組(n=89)、TPOAb陽

6、性對(duì)照組(n=34人)和TPOAb陰性對(duì)照組(n=656)。在妊娠第14、20、30周進(jìn)行隨訪，測定上述指標(biāo)，觀察各指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化及L-T4干預(yù)是否能降低TPOAb滴度。同時(shí)探討TPOAb與甲功、鐵營養(yǎng)狀態(tài)之間的關(guān)系。
　　測定14對(duì)母血與臍帶血的TPOAb、TSH、FT4、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)水平，ELISA法測定母血與臍帶血TPOAb IgG亞類。分析和比較母血及臍帶血TPOAbIgG亞類組成比例的異同及各IgG亞類的胎

7、盤通過率;分析母血與臍帶血TPOAb及其IgG亞類之間的相關(guān)關(guān)系。
　　SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SHEP數(shù)據(jù)以中位數(shù)（25th，75th百分位數(shù)）的形式表示，各指標(biāo)隨妊娠期動(dòng)態(tài)變化采用非參數(shù)檢驗(yàn)中多個(gè)相關(guān)樣本分布檢驗(yàn)。妊娠各期TPOAb與其他參數(shù)的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析，協(xié)方差分析比較干預(yù)前后TPOAb滴度變化。TPOAb陽性干預(yù)組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組各期數(shù)據(jù)組間比較采用秩和檢驗(yàn)。妊娠7周橫斷面數(shù)據(jù)按TP

8、OAb≥300 IU/L分層比較時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。IgG亞類分析中，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)誤）的形式表示。兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)的比較采用One-way ANOVA，LSD法分析，對(duì)擬分析數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，故相關(guān)分析采用Pearson雙變量相關(guān)分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　TPOAb陽性干預(yù)組各隨訪時(shí)點(diǎn)TPOAb中位數(shù)分別為271.90、155.70、119.

9、30及81.04 IU/L。隨妊娠時(shí)間推移，各個(gè)隨訪時(shí)間點(diǎn)TPOAb滴度均較前一時(shí)間點(diǎn)顯著下降(p=0.000)。妊娠30周較妊娠7周TPOAb滴度下降了70.1％。
　　TPOAb陽性對(duì)照組各隨訪時(shí)點(diǎn)TPOAb中位數(shù)分別為180.00、145.70、92.07及63.23 IU/L。妊娠30周較妊娠7周TPOAb滴度下降了65.0％。
　　妊娠7周橫斷面，應(yīng)用Spearman秩相關(guān)我們發(fā)現(xiàn):TSH與TPOAb呈顯著正相關(guān)(

10、r=0.128，p=0.000)、FT4與TPOAb顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.121，p=0.001）。但按照TPOAb是否≥300 IU/L進(jìn)行分層時(shí)，TPOAb陽性的兩層內(nèi)各指標(biāo)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，未觀察到SF、TSH、FT4等指標(biāo)與TPOAb間存在相關(guān)性。兩層數(shù)據(jù)與TPOAb陰性對(duì)照組比較時(shí)，均比陰性對(duì)照組FT4顯著降低（p值均＜0.01），且TSH顯著升高(p＜0.05)。在隨后的觀察中TPOAb陽性干預(yù)組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組各個(gè)

11、時(shí)點(diǎn)內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)TPOAb與上述指標(biāo)間存在相關(guān)關(guān)系。應(yīng)用L-T4干預(yù)對(duì)TPOAb影響的效果分析提示L-T4不能進(jìn)一步降低TPOAb滴度。
　　母血與臍帶血TPOAb IgG亞類的構(gòu)成比例無顯著差異;母血IgG1與臍帶血IgG1正相關(guān)(r=0.725，p=0.003)、母血IgG4與臍帶血IgG4正相關(guān)(r=0.907，p=0.000); TPOAb IgG1、IgG3亞類胎盤通過率顯著高于IgG2和IgG4亞類（p值均＜0.05）。

12、
　　結(jié)論：
　　1、妊娠期TPOAb水平逐漸下降，應(yīng)用L-T4干預(yù)不能進(jìn)一步降低TPOAb的滴度。
　　2、妊娠期TPOAb陽性與SF、TSH、FT4無相關(guān)性，L-T4干預(yù)沒有影響TPOAb和上述指標(biāo)的相關(guān)性。
　　3、妊娠末期TPOAb IgG1、IgG3亞類胎盤通過率最高。
　　第二部分 甲狀腺過氧化物酶抗體升高的動(dòng)物模型的建立
　　背景：
　　甲狀腺過氧化物酶(thyroid perox

13、idase，TPO)是一種糖基化血紅素蛋白，是甲狀腺激素合成的關(guān)鍵酶，參與甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)分子上酪氨酸殘基的碘化與碘化酪氨酸的偶聯(lián)。TPO是微粒體抗原的主要成分，是甲狀腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）的器官特異性自身抗原。
　　近十余年來，TPOAb陽性婦妊娠與妊娠不良結(jié)局之間的關(guān)系逐漸得到了人們的認(rèn)識(shí)和關(guān)注。TPOAb陽性婦女妊娠與流產(chǎn)、早產(chǎn)等妊娠不良結(jié)局及不孕之間相

14、關(guān)。在眾多妊娠不良結(jié)局中，TPOAb陽性婦女妊娠影響后代的智力發(fā)育引起了我們的關(guān)注。Pop等于1995年研究發(fā)現(xiàn)妊娠期間甲功正常TPOAb陽性婦女生育的后代，出生后5年其反映智商的一般認(rèn)知量表(general cognitive scale)得分較抗體陰性母親生育的后代低10.5分(p=0.005)，該研究表明妊娠期甲功正常TPOAb升高是后代發(fā)育受損的危險(xiǎn)因素。本課題組李元賓等在對(duì)妊娠16-20周TPOAb陽性甲功正常的婦女生育的后代

15、進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn):在其25-30月齡時(shí)進(jìn)行智力評(píng)分和運(yùn)動(dòng)評(píng)分，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組分別低10.56分(p＜0.01)和9.03分(p＜0.01)。這提示TPOAb陽性在妊娠16-20周時(shí)可能給后代智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)育造成不良影響。
　　目前，TPOAb影響后代智力的機(jī)制尚不清楚且缺乏相關(guān)機(jī)制研究的報(bào)告，亟需通過構(gòu)建TPOAb升高的動(dòng)物模型來探討相關(guān)機(jī)制，豐富我們對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)，為臨床干預(yù)提供可能的選擇。因此，本研究擬建立TPOAb升高的動(dòng)

16、物模型，為下一步的機(jī)制研究做準(zhǔn)備。
　　方法：
　　將構(gòu)建好的插入了小鼠甲狀腺過氧化物酶cDNA全長的腺病毒載體(mTPO-Ad)CMV-MCS GV269體外感染HepG2細(xì)胞，Western Blot鑒定是否有目的蛋白表達(dá)。
　　經(jīng)鑒定后，8周齡C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫。分別給予:腺病毒1.0×1010PFU/只·次（A組）10只;腺病毒2.5×109PFU/只·次（B組）10只;對(duì)照組（C組）給予PBS14

17、0μ L/只·次10只，大腿肌肉注射，共3次，每次間隔3周。
　　于免疫完畢后的第3、6、9周內(nèi)眥靜脈采血分離血清，第12周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物留取血清和甲狀腺。
　　ELISA法檢測各個(gè)采血點(diǎn)小鼠TPOAb(mTPOAb)、小鼠甲狀腺球蛋白抗體(mTgAb)，免疫完畢后第3周、第12周的血清促甲狀腺素(TSH)、游離甲狀腺素(FT4)，免疫結(jié)束后第12周的甲狀腺進(jìn)行HE染色甲狀腺炎評(píng)分、甲狀腺淋巴細(xì)胞CD45分子染色及ELISA法

18、檢測血清干擾素(IFN)-γ、白細(xì)胞介素(IL)-2、4、10。
　　為了使mTPOAb進(jìn)一步升高，我們選取新的6周齡C57BL/6雌鼠進(jìn)行了第二批免疫。免疫方法同上，免疫劑量為2.0×1010PFU/只·次（D組，10只），對(duì)照組給予PBS200μ L/只·次(C2組，10只)。于免疫完畢后第6周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，ELISA法檢測血清mTPOAb、mTgAb、TSH、FL，甲狀腺進(jìn)行HE染色觀察甲狀腺炎，小鼠脾細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)測定輔助

19、性T細(xì)胞(Th)1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例。
　　ELISA法測定小鼠（mTPOAb升高組，E組和對(duì)照組C3組各6只）血清中mTPOAbIgG總及IgG各亞類。分析IgG各亞類的組成情況，分析IgG各亞類與mTPOAb IgG總水平之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　Western Blot僅mTPO-Ad組在130KD處顯示特征性條帶。
　　動(dòng)物免疫后，其中A組各個(gè)采血時(shí)點(diǎn)mTPOAb滴度

20、均較C組升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p值分別為0.012，0.012，0.015及0.037），B組在免疫結(jié)束后第12周時(shí)mTPOAb滴度較C組升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.010)。各組間各時(shí)點(diǎn)的mTgAb滴度比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫后第12周A組血清IFN-γ較C組顯著升高(p=0.039)。
　　A組、B組、C組甲炎評(píng)分的平均秩次分別為7.20，7.80，3.80。其中B組與C組相比甲炎評(píng)分升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p=0.039（秩和檢驗(yàn)）。C

21、D45免疫組織化學(xué)染色可見A組、B組甲狀腺組織中有一定量的淺棕色的細(xì)胞分布，且C組中該種著色細(xì)胞很少或沒有。
　　D組較C2組mTPOAb滴度顯著升高(p=0.017)，而TgAb滴度、甲功水平無差異。流式細(xì)胞染色各T細(xì)胞亞群兩組比較無差異。甲狀腺HE染色兩組均未觀察到典型淋巴細(xì)胞浸潤。
　　E組IgG2a及IgG2b的水平要明顯高于C3組（p值分別為0.019及0.014）;在各IgG亞類所占比例中，E組IgG1比例顯著低