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文檔簡(jiǎn)介
1、本文對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞(hDC)分泌的EXO負(fù)載NY-ESO-1抗原促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠特異性CTL擴(kuò)增及增強(qiáng)殺傷腫瘤效應(yīng)進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)貼壁法,選用HLA-A2陽(yáng)性健康成人的外周白膜血分離PBMC,使用rhGM-CSF和rhIL-4將PBMC體外誘導(dǎo)一周,成為未成熟的人DC(ihDC),加入自身淋巴細(xì)胞制成的凍融抗原用以增加外泌體(Exosomes,EXO)分泌量。再加入促成熟因子脂多糖(LPS),24小時(shí)后得到成熟的人DC(mhDC)。
2、收集mhDC培養(yǎng)體系的上清,利用一系列不同速度離心結(jié)合膜過(guò)濾的方法,從其上清中提取mhDC分泌的EXO。使用冰浴的方法,人工負(fù)載腫瘤睪丸抗原(CTA)NY-ESO-1肽段于經(jīng)過(guò)蛋白定量和酸洗之后的EXO(EXOAg)上。使用這種EXOAg(10ug)與polyI:C(50ug)在右后腿內(nèi)側(cè)皮下部位聯(lián)合注射,免疫健康HLA-A2轉(zhuǎn)基因C57小鼠。四周后,取脾細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。同時(shí),將小鼠雙后肢骨髓沖出,利用小鼠骨髓造血干細(xì)胞多向分化的潛能
3、,在培養(yǎng)體系中加入小鼠粒系單核系集落刺激因子(rmGM-CSF)體外誘導(dǎo)成為未成熟的小鼠DC(imDC),用于隨后的NY-ESO-1抗原肽是否能促imDC成熟的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。給imDC中加入LPS,24小時(shí)后成為成熟的小鼠DC(mmDC),用于小鼠脾細(xì)胞的體外孵育。通過(guò)人HLA-A2分子與鼠免疫球蛋白(IgG1)嵌合的四聚體結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞中NY-ESO-1抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxin T lympha cell,CT
4、L)有所擴(kuò)增。通過(guò)DiOC-18聯(lián)合PI的方法,測(cè)定脾細(xì)胞對(duì)表達(dá)NY-ESO-1抗原的慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞系(K562細(xì)胞系)有一定殺傷效應(yīng)。體外刺激實(shí)驗(yàn)步驟如下:mmDC先與EXOAg在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)后,再加入分離出的小鼠脾細(xì)胞以及重組小鼠白介素2(rmIL-2)100IU/mL,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育一周,補(bǔ)加mmDC和rmIL-2,至第二周進(jìn)行四聚體實(shí)驗(yàn)和DiOC-18聯(lián)合PI殺傷實(shí)驗(yàn)。體外兩輪刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示
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