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文檔簡介
1、目的:
我國是乙肝大國,慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)患者人數(shù)眾多,由其導致的終末期肝病嚴重威脅人們健康。有效的抗病毒治療可以減少肝纖維化、肝硬化、肝癌等并發(fā)癥的發(fā)生,顯著改善預后。目前乙肝抗病毒治療的藥物主要分為兩大類,一類為核苷類似物(Nucleotide Analogues,NAs),在我國使用的NAs主要有4種:拉米夫定(LAM),阿德福韋酯(ADV),替比夫定(LDT),恩替卡韋(ET
2、V)。另一類藥物為干擾素(IFN),包括普通IFN和長效IFN(Peg-IFN)。NAs和IFN作用特點各有不同:NAs抑制病毒復制的作用很強,同時口服給藥,攜帶使用方便,副作用較小。缺點是較難獲得理想的治療終點,即HBeAg/HBsAg血清學轉換或者HBsAg的清除,同時停藥后容易復發(fā)。另外NAs需要長時間服藥,易導致耐藥的風險。IFN的治療優(yōu)勢是有限療程(一般12個月,有的可以延長到18個月),以及高的HBeAg/HBsAg血清學轉
3、換率和清除率,獲得持久的免疫學控制,停藥后復發(fā)率低。缺點是使用較為復雜,副作用較多,同時病毒自身可進化并開發(fā)出各種策略抑制IFN相關信號通路的活化,導致IFN使用效率降低。CHB患者的優(yōu)化/個體化治療已成為國內(nèi)外研究的熱點,已經(jīng)有很多學者嘗試利用IFN和NAs這兩類藥物各自的優(yōu)勢,采用更好的治療方案,例如聯(lián)合,序貫治療,以獲得更好的臨床治療效果。
從IFN的分子機制來說,在乙肝抗病毒治療中它是唯一同時具有抗病毒和直接免疫調(diào)節(jié)作
4、用的藥物。體外研究表明:IFN抗病毒效應是通過如下機制實現(xiàn)的,IFN進入體內(nèi)后首先與細胞表面IFN受體結合,活化多種信號分子,例如STAT1(信號轉導和轉錄激活分子1),進而激活經(jīng)典的JAK/STAT信號通路,誘導下游抗病毒效應基因的產(chǎn)生而發(fā)揮抗病毒作用。在這些效應基因中,以抗粘液病毒蛋白(MxA),2‘,5‘-寡腺苷酸合成酶(2‘,5‘-OAS),蛋白激酶R(PKR)等最為重要。MxA是IFN誘導產(chǎn)生的分布于細胞質中的蛋白質,具有廣譜
5、的抗病毒活性,對正黏病毒、棒狀病毒、小RNA病毒及乙肝病毒均有強大的抑制作用。而2‘,5‘-OAS可以啟動核酸水解酶,通過選擇性地降解病毒RNA來發(fā)揮抑制病毒的作用。JAK/STAT通路存在一些負性調(diào)控基因來抑制其活化,在IFN激活JAK/STAT通路的同時,這些負性調(diào)控基因也會通過負反饋被激活,來避免信號通路的過度活化。在這些負性調(diào)控因子中,以SOCS3(細胞因子信號通路抑制分子3)、PIAS(STAT1激活抑制蛋白)等最為重要。SO
6、CS3能通過結合磷酸化的細胞因子受體,使JAKs失活,抑制信號轉導。相比較而言,PIAS更像緩沖劑,通過控制活化STAT的數(shù)量來調(diào)節(jié)靶基因的轉錄。
在慢性乙型肝炎治療中,IFN應答率并不高,說明IFN抵抗的情況可能出現(xiàn)在慢性乙肝患者治療中。同時IFN在治療慢性乙型肝炎過程中發(fā)揮抗病毒,免疫調(diào)節(jié)作用以及病毒抵抗IFN的分子機制尚未完全闡明。OSST臨床研究是一項在HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者中使用Peg-IFN-α和ETV聯(lián)合
7、或序貫治療以優(yōu)化血清學轉換的研究,本文的研究對象為一部分來自OSST臨床試驗的患者。我們將患者臨床應答情況與IFN的信號通路研究相結合,觀察不同臨床結局患者外周血和肝組織中相關信號分子的表達情況,并進一步比較其差異。研究結果為使用NAs治療的CHB患者優(yōu)化治療策略提供了新的理論依據(jù)。同時深化了對IFN治療CHB患者相關分子機制以及病毒抵抗機制的理解,為進一步尋找IFN治療相關預測指標以及靶點提供了新的研究思路。
本研究內(nèi)容如下
8、:
1.將E抗原陽性慢性乙型肝炎經(jīng)治患者(使用ETV治療,并獲得持續(xù)病毒學控制的患者)隨機分為兩組,A組序貫使用IFN治療,B組繼續(xù)使用ETV治療。同時在治療過程中觀察相關臨床指標HBV DNA、HBeAg、HBsAg、ALT的動態(tài)變化,并比較48周,96周時兩組間總應答率(HBeAg/HBsAg血清學轉換,HBsAg清除)的差異,以期望能發(fā)揮兩種藥物各自的優(yōu)勢,使患者獲得更加理想的治療終點。
2.觀察患者PBMC和
9、肝組織中IFN相關信號通路分子治療過程中的動態(tài)變化并比較組間(有應答和無應答組)差異,同時結合臨床應答,嘗試建立兩者間的聯(lián)系。
方法:
1.基于上述研究背景,選取同濟醫(yī)院單中心的E抗原陽性慢性乙型肝炎經(jīng)治患者(這些患者屬于OSST臨床研究中的一部分)。入組標準為已使用ETV治療9-36月,HBV DNA陰性但未發(fā)生HBeAg血清學轉換。按照隨機分組的原則將患者分到A組和B組,每組各27名患者。A組使用Peg-IFN規(guī)
10、范治療一年(初始8周使用ETV+IFN聯(lián)合治療),治療結束后繼續(xù)隨訪一年,B組繼續(xù)使用ETV治療。治療過程中動態(tài)觀察臨床相關指標的變化,并在48周,96周時比較兩組間總應答率的差異。
2.為了深入研究IFN信號通路以及其下游的抗病毒效應分子和治療應答的關系,收集了本中心A,B兩組各27名慢性乙型肝炎患者不同時間點(0、4、12、24、36、48、72、96周)的外周血標本并分離PBMC,將PBMC分別提取RNA和蛋白。使用Re
11、al Time PCR檢測PBMC中STAT1,MxA,2‘,5‘-OAS和SOCS3在治療過程中的動態(tài)變化情況,同時使用Western-Blot方法檢測了IFN信號通路關鍵分子磷酸化STAT1的表達。
3.收集了部分A組患者治療前后(0,48周)肝組織標本,采用Real Time PCR方法檢測了治療前后STAT1,MxA,2‘,5‘-OAS以及SOCS3的表達,同時用免疫組織化學(IHC)的方法檢測了肝組織中磷酸化的STA
12、T1以及SOCS3在治療前后的表達情況,以進一步明確IFN治療前后信號通路關鍵分子,負性調(diào)控基因與治療結局之間的聯(lián)系。
結果:
1.A,B兩組患者基線特征無差異。A組內(nèi)有應答患者和無應答患者基線HBsAg有顯著差異,治療過程中A組患者HBsAg的下降幅度顯著高于B組,A組內(nèi)有應答患者HBsAg治療過程中下降幅度顯著高于無應答患者。在48周,96周時,A組的總應答率(HBeAg/HBsAg血清學轉換,HBsAg清除)高
13、于B組(22.2%vs3%,37%vs3%)。
2.A組患者在使用IFN治療后,PBMC中STAT1,MxA,2‘,5‘-OAS,SOCS3的mRNA水平均有增高,而使用NAs治療的B組患者PBMC中這些分子的表達沒有明顯變化。進一步在A組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),A組內(nèi)應答和未獲得應答患者PBMC中基線SOCS3的mRNA水平有顯著差異。與基線相比較,A組有應答患者PBMC中4周時STAT1和4周,12周時MxA的mRNA增長幅度顯著高于
14、未獲得應答的患者。和基線相比較,4周時磷酸化STAT1蛋白水平的增長幅度在A組有應答和無應答患者間有顯著差異。HBsAg的下降幅度(0周-48周)分別和STAT1,MxA的mRNA增長幅度(STAT14周/0周,MxA12周/0周)正相關。
3.A組患者肝組織磷酸化STAT1免疫組化染色結果顯示:未獲得應答者基線磷酸化STAT1的表達顯著高于有應答患者,有應答患者48周時磷酸化的STAT1表達較基線相比明顯上調(diào),無應答患者48
15、周時磷酸化STAT1的表達水平未見明顯變化。和基線相比,有應答患者48周STAT1,MxA的mRNA水平增長幅度顯著高于無應答患者。有應答患者48周時SOCS3的mRNA水平的上調(diào)幅度顯著低于無應答患者,SOCS3免疫組化染色結果也進一步證實了這一結果。
結論:
1.在NAs治療取得了持續(xù)病毒學應答,但未出現(xiàn)血清學轉換的慢性乙肝患者,轉換為序貫使用IFN治療可以有效提高此類患者的血清學轉換率,獲得理想的治療終點。從研
16、究結果來看,這種序貫治療方案治療效果優(yōu)于繼續(xù)單用NAs治療。
2.在PBMC中的研究表明:IFN信號通路中的STAT1分子,下游抗病毒蛋白MxA mRNA水平早期的增長幅度以及SOCS3的基線水平和患者的治療結局有關,STAT1和MxA的增長幅度和治療過程中HBsAg的下降程度正相關,提示這些基因一定程度上可以預測IFN的療效。
3.肝組織中研究表明:基線磷酸化STAT1水平較高的患者對IFN治療的應答較差,48周時
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