白蛋白修飾的人甲狀旁腺激素的制備、純化及活性研究.pdf

1、甲狀旁腺激素(PTH)是調(diào)節(jié)骨代謝的重要激素之一。小劑量間歇性給予PTH可以增加骨形成，使骨量上升。為了提高PTH的穩(wěn)定性和體內(nèi)的半衰期，利用先期構(gòu)建的酵母工程菌Pichia pastoris KM71/PTH-HSA進(jìn)行了人甲狀旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白(PTH-HSA)制備和純化方法的研究，并對(duì)其藥效活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　 論文研究了該菌株的生長(zhǎng)曲線，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了誘導(dǎo)PH6.5，溫度30℃，每24h添加甲醇，保持甲醇

2、濃度在2.5%，誘導(dǎo)時(shí)間為4d，融合蛋白PTH-HSA的搖瓶發(fā)酵最優(yōu)條件。在該條件下表達(dá)量最高達(dá)180mg/L。
　　 建立了兩種融合蛋白PTH-HSA的分離純化路線并進(jìn)行了比較。路線一發(fā)酵液經(jīng)超濾濃縮、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾純化，目的蛋白回收率約為20%。路線二發(fā)酵液經(jīng)超濾濃縮，染料親和層析純化，目的蛋白回收率為61%，所得融合蛋白PTH-HSA純度達(dá)到95%。Western雜交顯示純化的融合蛋白PTH-HSA具有很好的HS

3、A和PTH抗原性，分子量約75 kDa，與理論預(yù)測(cè)值相同。
　　 間隙加藥于成骨細(xì)胞，通過(guò)MTT法和PNPP偶氮法觀察比較PTH-HSA和PTH對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響。通過(guò)檢測(cè)骨基質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞，C57/Black小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL和OPG基因的表達(dá)，比較PTH-HSA與PTH(1-34)多肽的生物活性。通過(guò)UAMS32骨基質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞與C57/Black小鼠骨髓懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察和比較PTH-HS