pEGFP-N1-α-synuclein真核表達載體的構(gòu)建及貫葉連翹抗抑郁作用機制研究.pdf

1、目的： 1.構(gòu)建pEGFP-N1-α-synuclein真核表達載體，觀察α-synuclein蛋白在細胞內(nèi)的表達情況及其對細胞的影響。 2.抑郁癥是一種常見的神經(jīng)疾患，嚴重影響人類的生存質(zhì)量。貫葉連翹被認為有抗抑郁作用，其主要有效成分為金絲桃素，貫葉金絲桃素等，在國外主要用于治療輕中度抑郁癥。金得康膠囊是以貫葉連翹提取物為原料藥的現(xiàn)代中藥制劑，其抗抑郁的作用機理尚不完全清楚。本課題通過一系列研究，探討金得康膠囊及其有效

2、成分對5-HT受體的影響，及其介導信號通路的改變，揭明金得康膠囊抗抑郁的作用機理。 方法： 1.pEGFP-N1-α-syn-uclein 載體的構(gòu)建及與帕金森氏病的相關(guān)研究 (1)pEGFP-N1-α-synuclein真核表達載體的構(gòu)建設(shè)計特異引物，PCR 擴增α-synuclein cDNA并引入FLAG標簽，克隆入 pEGFP-N1 質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行酶切及測序，鑒定正確后轉(zhuǎn)化Ecoli．DH5α大腸

3、桿菌，大量擴增重組質(zhì)粒。試劑盒純化重組質(zhì)粒。用Lipofectamine<'TM> 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞，熒光顯微鏡檢測報告基因EGFP表達產(chǎn)物綠色熒光蛋白、Western blot檢測融合蛋白在細胞內(nèi)的表達。 (2)MPP<'+>對PD細胞模型的影響。構(gòu)建了pcDNA3.1/hisC-α-synuclein真核表達質(zhì)粒，并建立了該質(zhì)粒在SIt-SY5Y穩(wěn)定表達的細胞株，作為PD研究的細胞模型。3-meth

4、y-4-benzyl-1，2,3，6-terathydrogenpgridine(MPTP)在腦內(nèi)代謝為MPP<'+>，產(chǎn)生氧自由基(ROS)，故用 MPP<'+>誘導產(chǎn)生PD模型。我們以該細胞株為研究對象，以不同濃度的MPP<'+>分別作用于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染α-synuclein的SH-SY5Y細胞，MTT法檢測細胞存活率及倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。 (3)α-synuclein與凋亡信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)分子關(guān)系的研究。用Li

5、pofectamine<'TM> 2000將α-synuclein和/或 JNK3 (PD相關(guān)基因)轉(zhuǎn)染 293T 細胞，采用Western blot方法檢測細胞凋亡相關(guān)基因Caspase3、cytochrom C在細胞內(nèi)的活性。 2.貫葉連翹提取物有效成分抗抑郁作用及其機制研究 (1)采用放射配體受體結(jié)合法測定金得康膠囊及其有效成分與大鼠腦組織5-HT<,1>受體的結(jié)合。 (2)本課題組已建立了穩(wěn)定表達5-H

6、T<,1a>受體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株，選取該細胞株，以不同濃度的金得康膠囊與CHO細胞共同孵育48h、72h、96h后，提取細胞蛋白，Western blot檢測 5-HT<,1a>受體表達情況。 (3)選取穩(wěn)定表達5-HT<,1a>受體的CHO細胞，接種于35mm激光共聚焦專用培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后，加入熒光染料FLUO-3 AM Ester，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h。取出培養(yǎng)皿，洗凈熒光染料，將培養(yǎng)皿放置于激光共聚焦顯微

7、鏡載物臺，在20×物鏡下，選取細胞活度、形態(tài)及負載良好的多個細胞，啟動機器進行熒光掃描，分別加入離子霉素(陽性對照)、金絲桃素、金得康膠囊，并繪制胞內(nèi)熒光強度變化的曲線。 (4)選取穩(wěn)定表達 5-HT<,1>受體的CHO細胞，接種于60mm培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后，以培養(yǎng)基稀釋金得康膠囊，以不同濃度，不同時間與CHO細胞孵育。按照Cyclic AMP EIA試劑盒說明，檢測細胞內(nèi)cAMP含量，分析其變化情況。 結(jié)論：

8、 1.pEGFP-N1-α-synuclein載體的構(gòu)建及與帕金森氏病的相關(guān)研究 (1)本研究成功構(gòu)建了人野生型α-synuclein與綠色熒光蛋白基因融合并加入FLAG標簽的真核表達載體pEGFP-N1-α-synuclein。 (2)本研究證實過表達α-synuclein 可以參與細胞凋亡的過程，與野生型SH-SY5Y相比，過表達α-synuclein的細胞株對MPP<'+>誘導的氧化應(yīng)激損傷具有更高的敏感性。

9、 2.貫葉連翹提取物有效成分抗抑郁作用及其機制研究 (1)構(gòu)建了5-HT<,1a>受體轉(zhuǎn)染CHO細胞的細胞株，為抗抑郁新藥的篩選及其作用機制的研究提供了重要的細胞模型。 (2)放射配體受體結(jié)合測定法實驗結(jié)果表明，貫葉連翹提取物和金得康膠囊抗抑郁作用的機制可能是通過與腦內(nèi) 5-HT<,1>受體結(jié)合，激活下游的轉(zhuǎn)導通路，產(chǎn)生抗抑郁作用。 (3) 有文獻報道，體內(nèi)實驗中，金得康膠囊原料藥貫葉連翹可以上調(diào)大鼠腦

10、組織5-HT<,1a>受體。實驗表明，金得康膠囊可以在細胞水平上調(diào)5-HT<,1a>受體，提高受體的敏感性，這與體內(nèi)結(jié)果報道一致，提示金得康膠囊抗抑郁的作用機理可能是通過上調(diào) 5-HT<,1a>受體表達，提高受體敏感性，產(chǎn)生抗抑郁作用。 (4)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放依賴于細胞內(nèi)游離鈣離子，對細胞內(nèi)游離鈣離子的檢測結(jié)果表明金得康膠囊和金絲桃素可以明顯提高細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，提示金得康膠囊對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放可能起到調(diào)節(jié)作用。 (5