pEGFP-N3-KLF2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1中TF表達(dá)的影響.pdf

1、動(dòng)脈血栓形成是急性心肌梗塞和腦梗死的主要誘因，也是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的死亡原因。組織因子(TF)是生理性止血和病理性形成血栓的啟動(dòng)因子，它在血栓形成中的起始作用越來(lái)越受到人們的重視。單核細(xì)胞作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TF來(lái)源的細(xì)胞-泡沫細(xì)胞的前身，研究其TF的表達(dá)調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，不穩(wěn)定型心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、高血壓和高血脂等心腦血管疾病患者血液中單核細(xì)胞的TF都處在高表達(dá)的水平；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，具有抗

2、血栓作用以及血管內(nèi)皮保護(hù)功能的KLF2基因在急性冠狀動(dòng)脈綜合癥病人的單核細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)。因此，本研究旨在構(gòu)建pEGFP-N3-KLF2高表達(dá)載體，并且觀察LPS對(duì)KLF2高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的影響，為豐富凝血理論提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：構(gòu)建pEGFP-N3-KLF2高表達(dá)載體，并且觀察LPS對(duì)KLF2高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的影響。
　　 方法：從NCBI獲得klf2基因序列，

3、運(yùn)用premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增klf2基因，電泳檢測(cè)正確后，進(jìn)行純化回收，然后將純化回收產(chǎn)物連pEGFP-N3載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再挑單克隆以及搖菌，小提質(zhì)粒，最后進(jìn)行雙酶切檢測(cè)和PCR檢測(cè)，當(dāng)兩項(xiàng)結(jié)果均正確時(shí)，送pEGFP-N3-KLF2新鮮菌液去測(cè)序。將單核細(xì)胞分為5組：①正常細(xì)胞組。②轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組，③轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒組。④LPS組。⑤LPS+轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒組。分別培養(yǎng)2 h、12 h、24 h、48 h和72 h

4、后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)TF蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：陽(yáng)性克隆篩選和測(cè)序結(jié)果顯示，pE-GFP-N3-KLF2高表達(dá)載體構(gòu)建成功。在實(shí)驗(yàn)觀察的2 h至72 h內(nèi)，正常組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)TF表達(dá)基本一致，各觀察點(diǎn)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與正常對(duì)照組相比，空載體組和高表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組TF表達(dá)也無(wú)顯著性差異(P>0.05)。LPS組表達(dá)TF從12 h起明顯增加，至48 h達(dá)到高峰，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)，