pEGFP-N3-KLF2真核表達載體的構(gòu)建及其對LPS誘導的THP-1中TF表達的影響.pdf

1、動脈血栓形成是急性心肌梗塞和腦梗死的主要誘因，也是發(fā)達國家最常見的死亡原因。組織因子(TF)是生理性止血和病理性形成血栓的啟動因子，它在血栓形成中的起始作用越來越受到人們的重視。單核細胞作為動脈粥樣硬化斑塊中TF來源的細胞-泡沫細胞的前身，研究其TF的表達調(diào)控機制已經(jīng)成為當前臨床醫(yī)學的熱點之一。國內(nèi)外大量研究表明，不穩(wěn)定型心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、高血壓和高血脂等心腦血管疾病患者血液中單核細胞的TF都處在高表達的水平；同時發(fā)現(xiàn)，具有抗

2、血栓作用以及血管內(nèi)皮保護功能的KLF2基因在急性冠狀動脈綜合癥病人的單核細胞中表達明顯下調(diào)。因此，本研究旨在構(gòu)建pEGFP-N3-KLF2高表達載體，并且觀察LPS對KLF2高表達載體轉(zhuǎn)染的THP-1細胞表達TF的影響，為豐富凝血理論提供新的實驗依據(jù)。
　　 目的：構(gòu)建pEGFP-N3-KLF2高表達載體，并且觀察LPS對KLF2高表達載體轉(zhuǎn)染的THP-1細胞表達TF的影響。
　　 方法：從NCBI獲得klf2基因序列，

3、運用premier5.0軟件設(shè)計引物，運用PCR技術(shù)擴增klf2基因，電泳檢測正確后，進行純化回收，然后將純化回收產(chǎn)物連pEGFP-N3載體進行轉(zhuǎn)化，再挑單克隆以及搖菌，小提質(zhì)粒，最后進行雙酶切檢測和PCR檢測，當兩項結(jié)果均正確時，送pEGFP-N3-KLF2新鮮菌液去測序。將單核細胞分為5組：①正常細胞組。②轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組，③轉(zhuǎn)染高表達質(zhì)粒組。④LPS組。⑤LPS+轉(zhuǎn)染高表達質(zhì)粒組。分別培養(yǎng)2 h、12 h、24 h、48 h和72 h

4、后，用流式細胞術(shù)檢測各組各時間點TF蛋白表達變化。
　　 結(jié)果：陽性克隆篩選和測序結(jié)果顯示，pE-GFP-N3-KLF2高表達載體構(gòu)建成功。在實驗觀察的2 h至72 h內(nèi)，正常組細胞各時間點TF表達基本一致，各觀察點間比較差異無統(tǒng)計學差異；與正常對照組相比，空載體組和高表達轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組TF表達也無顯著性差異(P>0.05)。LPS組表達TF從12 h起明顯增加，至48 h達到高峰，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學差異(p<0.01)，