變異鏈球菌重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+的構(gòu)建及真核表達(dá).pdf

1、齲病是一種以細(xì)菌為主的多種因素共同作用的牙體硬組織疾病，變異鏈球菌（S.mutans，簡稱變鏈菌）是目前公認(rèn)的主要致病菌之一。變異鏈球菌在牙面粘附、聚集、增殖和產(chǎn)酸是其致齲的主要過程，因此，阻斷變異鏈球菌在牙面粘附、聚集，可降低齲病的發(fā)生率。目前，免疫學(xué)預(yù)防措施是控制齲病的重要手段之一。基因疫苗，是上世紀(jì)90年代初逐漸發(fā)展起來的一種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的新方法，是預(yù)防免疫醫(yī)學(xué)史上的又一座里程碑，被譽(yù)為第三次疫苗革命。其基本原理是將外源性基因直接

2、導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)對目的基因所表達(dá)的蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。
　　 變鏈菌表面蛋白（surface protein antigen，SpaP）是介導(dǎo)變鏈菌在牙面粘附、聚集的主要功能區(qū)。變鏈菌表面蛋白可變區(qū)（SrV+，V區(qū)）兩端連接著具有高度保守性的A區(qū)和P區(qū)，并可與A區(qū)或P區(qū)協(xié)同發(fā)揮致齲作用。SrV+具有粘附和凝集作用，參與變鏈菌在牙面粘附、聚集；同時(shí)，SrV+內(nèi)有B細(xì)胞表位，可單獨(dú)發(fā)揮免疫

3、原性；SrV+蛋白還可以通過植物凝集素樣物質(zhì)，刺激單核細(xì)胞釋放TNF-α因子。因此，變鏈菌表面蛋白SrV+是其重要的毒力因子，參與致齲過程，SrV+編碼基因?yàn)閟rv+。
　　 [目的]本研究根據(jù)已報(bào)道的變鏈菌表面蛋白SrV+基因srv+的核苷酸序列，化學(xué)合成其編碼基因，鑒定無誤后，將此片段連接到加強(qiáng)型綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T，并檢測其

4、目的蛋白表達(dá)情況，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。
　　 [方法]本研究分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)
　　 實(shí)驗(yàn)一：重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+的構(gòu)建
　　 根據(jù)已報(bào)道的srv+基因核苷酸序列，化學(xué)合成SrV+的編碼基因srv+，將載體質(zhì)粒pEGFP-N1和測序正確的srv+基因片段分別用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切形成粘性末端，進(jìn)行連接反應(yīng)，獲取重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+，進(jìn)一步對其進(jìn)行PCR、酶切和測序鑒定。

5、>　　 實(shí)驗(yàn)二：重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+在真核細(xì)胞中的表達(dá)
　　 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T。運(yùn)用免疫組化SABC法和熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白標(biāo)記的目的蛋白在真核細(xì)胞293T中表達(dá)的情況。
　　 [結(jié)果]通過基因化學(xué)合成技術(shù)，獲得1136bp的目的基因srv+核苷酸序列，與設(shè)計(jì)的目的基因序列一致；目的基因srv+和載體pEGFP-N1分別雙酶切制備后連接，成

6、功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-srV+；PCR擴(kuò)增可獲得1.33Kb目的基因片段；KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切可見4.7kb和1.1kb兩條電泳條帶；經(jīng)測序分析合成片段srv+的序列與變鏈菌UA159基因序列比對同源性為96％，重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+攜帶目的基因；通過熒光顯微鏡觀察和免疫組化SABC法檢測，質(zhì)粒pEGFP-N1-SrV+轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293T后，在細(xì)胞中可見目的蛋白SrV+特異性表達(dá)。
　　 [結(jié)論]