pEGFP-Cl-MyD88真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體，該家族通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)激活免疫細(xì)胞，在天然免疫防御病原體中起著重要作用。髓樣分化因子88(myeloiddifferentiation factor88，MyD88)作為一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)接頭蛋白，在TLR家族和白介素1受體(interleukin1

2、receptor，IL-1R)家族信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MyD88蛋白具有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：N端的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)、中間區(qū)域(intermediate domain，ID)及C端的Toll樣受體和白介素1受體相關(guān)結(jié)構(gòu)域(TLR/IL-1R related domain，TIR)，其中MyD88蛋白的TIR結(jié)構(gòu)域能與TLRs和IL-1Rs的TIR結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而介導(dǎo)信號(hào)向下游傳導(dǎo)。MyD88是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)接蛋

3、白，其介導(dǎo)的信號(hào)通路與腸炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥大、癌癥等在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程有著密切的聯(lián)系。MyD88的結(jié)構(gòu)和功能研究將為這些疾病的治療提供新的方向和思路。
　　 本研究以水牛外周血白細(xì)胞為材料，提取總RNA，通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增MyD88基因全長(zhǎng)編碼序列，將其連接至pEGFP-C1質(zhì)粒，構(gòu)建pEGFP-C1-MyD88真核重組表達(dá)載體，重組載體經(jīng)菌落PCR、酶切和測(cè)序鑒定后，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293

4、細(xì)胞中，使其發(fā)生瞬時(shí)表達(dá)，并通過(guò)G418抗性篩選，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP-MyD88融合蛋白的HEK293細(xì)胞系。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染48h后，綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中呈顆粒狀散在分布，而在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞中均勻分布；Western Blot結(jié)果顯示在62 kDa處出現(xiàn)一條特異性抗體結(jié)合條帶；經(jīng)過(guò)G418的持續(xù)篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的陽(yáng)性克隆，F(xiàn)CM分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空質(zhì)粒的細(xì)胞系陽(yáng)性率達(dá)93.35％，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)