HLA-E基因RNA干擾和過表達在肝癌細胞Bel7402中對NK細胞免疫監(jiān)視功能的影響.pdf

1、研究背景: 腫瘤免疫中，機體的細胞免疫起主要作用，NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是機體抵抗腫瘤生長和病毒感染的重要免疫效應(yīng)細胞。 T淋巴細胞是腫瘤特異性、并受HLA-I分子限制，其免疫啟動是癌細胞HLA-I分子向T淋巴細胞TCR遞呈免疫原性多肽。癌細胞表面經(jīng)典HLA—I分子的丟失是腫瘤生物學(xué)中一個普遍現(xiàn)象，這正是腫瘤針對T淋巴細胞采取的一種主要逃逸機制。 NK細胞不同于CTL，其能識別腫瘤細胞HLA-I類

2、分子表達的變異、下降或缺如，對靶細胞進行殺傷。 HLA—E是功能和作用途徑最為明確的主要非經(jīng)典HLA-I類分子。HLA—E對NK細胞的作用可能是雙重的，即抑制或活化，其效應(yīng)與‘NK細胞表面的受體類型有關(guān)。 抑制性受體保護表達HLA-I類分子的正常細胞免受NK細胞的攻擊，而當靶細胞表面HLA-I類分子表達降低、丟失或發(fā)變異時，NK細胞才能活化并啟動對靶細胞的殺傷，此即NK細胞的"missing self"識別模式。

3、 目的: 在mRNA和蛋白水平上，研究HLA-E在胎肝細胞系和五種肝癌細胞系中的表達情況及其可能地位；通過RNAi技術(shù)，下調(diào)肝癌Bel7402細胞的HLA-E基因表達，研究NK細胞對其殺傷作用的影響；通過慢病毒載體攜帶HLA-E基因過表達，使肝癌Bel7402細胞的HLA-E基因上調(diào)，以研究其對NK細胞腫瘤殺傷作用的影響。通過上述兩種技術(shù)，探討HLA-E基因在NK介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視中的作用。 方法: 通

4、過RT-PCR、Western Blot技術(shù)研究五種肝癌細胞系和胎肝細胞系中HLA-E mRNA水平和蛋白水平的表達情況；構(gòu)建pGCsi-U6／Neo／GFP／HLA-E和LentiVims／CMV／GFP—HLA—E重組慢病毒載體；分別轉(zhuǎn)染或感染Bel7402細胞，觀察NK細胞對Bel7402的免疫監(jiān)視作用。 結(jié)果: 1、Real Time PCR檢測顯示，HepG2細胞、Bel7402細胞、PLC細胞、MHCC97細

5、胞、Hep382.1-7細胞與L02細胞在HLA-E mRNA水平比較，除Hep382.1-7細胞表達幾乎接近缺失外，統(tǒng)計學(xué)上無差異(P>0.05)。Western Blot檢測HepG2細胞、Bel7402細胞、PLC細胞、MHCC97細胞、Hep382.1-7細胞與LO2細胞在HLA-E蛋白水平比較，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(P<0.01)，其中Hep382.1-7細胞表達缺失。 2、Real Time PCR結(jié)果顯示，NC、H

6、LA-E1、HLA-E2、HLA-E3、HLA—E4組mRNA水平的抑制率分別為10.5％、55.5％、34.O％、73.0％、30.7％：Westem Blot 結(jié)果顯示，NC、HLA-E1、HLA．E2、HLA．E3、HLA．E4組蛋白水平的抑制率分別為15％、62.7％、60.5％、73.6％、51.7％。 3、Lentivirus／CMV／GFP-HLA-E重組慢病毒載體感染Bel7402細胞后，在mRNA水平和蛋白水平

7、與Bel7402對照組比較，統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性差異(P<0.01)。 4、未封閉組：Bel7402組和Bel7402 HLA—E3組、Bel7402 Lenti HLA-E組比較，NK細胞的殺瘤活性均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其中HLA-E基因RNA干擾組和未干擾組具有顯著性差異(P<0.01)． 5、封閉組和未封閉組比較，NK細胞的殺瘤活性均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論: 1、肝癌細胞系

8、(HepG2、Bel7402、PLC、MHCC97、Hep382.1-7)與胎肝細胞系(LO2)比較，HLA基因在mRNA水平，除Hep382.1-7細胞表達幾乎接近缺失外，其它細胞表達無明顯的差異；在蛋白水平上，肝癌細胞系普遍表達較低，Hep382.1-7細胞表達缺失； 2、成功構(gòu)建pGCsi-U6／Neo／GFP／HLA-E載體，在mRNA水平和蛋白水平有效抑制效率分別為73.0％和73.6％； 3、成功構(gòu)