RNA干擾阻斷MIF基因表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，每年約有40-50萬新發(fā)病例。我國(guó)肝癌的死亡率僅次于胃癌和食道癌位于第三位，每年約有10萬人死于該病。HCC多見于青壯年男性，經(jīng)診斷后平均存活期約為6個(gè)月。盡管近年來早期肝癌發(fā)現(xiàn)率的提高以及治療技術(shù)的進(jìn)步使肝癌的死亡率有所降低，但由于HCC復(fù)發(fā)率高，容易發(fā)生肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移，常規(guī)放化療效果不佳，故HCC病人總體預(yù)后不良。HCC的復(fù)發(fā)和高死亡率

2、與腫瘤細(xì)胞快速增殖、多結(jié)節(jié)生長(zhǎng)，血管侵潤(rùn)，易血道轉(zhuǎn)移等諸多因素相關(guān)，因此，對(duì)HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的進(jìn)一步研究將利于尋求分子靶標(biāo)并探索新的治療方法。
　　 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）最初是作為激活的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種可溶性淋巴因子被發(fā)現(xiàn)。其具有抑制巨噬細(xì)胞移走﹑粘俯和吞噬的功能。近來的研究表明，MIF在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，提示MIF與腫瘤的

3、發(fā)生關(guān)系密切。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MIF參與了HCC發(fā)生和發(fā)展。
　　 隨著后基因組時(shí)代的到來，越來越多基因的功能被揭示，許多與疾病相關(guān)的基因及治療的有效靶點(diǎn)被確認(rèn)。利用RNA干涉技術(shù)沉默致病基因，可實(shí)現(xiàn)快速、高效、特異的基因治療。有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用siRNA阻斷Survivin、Cyclin E的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖。關(guān)于應(yīng)用siRNA阻斷MIF表達(dá)來研究MIF控制HCC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，至今為止尚未見另有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 本

4、研究以免疫組織化學(xué)研究HCC組織中MIF和cyclinD1的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系為基礎(chǔ)，進(jìn)一步應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，化學(xué)合成與MIF mRNA匹配的雙鏈小干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞系，特異地阻斷或抑制MIF表達(dá)。用免疫印跡方法和免疫熒光檢測(cè)MIF表達(dá)及有關(guān)細(xì)胞增殖及存活信號(hào)分子MAPK/ERK﹑ AKT、GSK3β、CyclinD1和Cdk4/6等的表達(dá)；定量RT-PCR檢測(cè)MIF和cyclinD1 mRNA變化；細(xì)

5、胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)觀測(cè)肝癌細(xì)胞行為學(xué)的改變；接種MIF siRNA和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞于裸鼠皮下，觀察比較皮下腫瘤生長(zhǎng)的體積。通過探討肝癌細(xì)胞自分泌MIF參于控制癌細(xì)胞增殖﹑遷移以及血管生成的分子機(jī)制，我們期望通過利用特異的siRNA阻斷MIF表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，揭示其相關(guān)機(jī)制并為臨床治療HCC和開發(fā)新一類抗腫瘤藥物提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子和細(xì)胞周期蛋白D1在肝細(xì)胞肝癌中

6、的表達(dá)
　　 目的：研究MIF、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在HCC組織中的表達(dá)及其可能的關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)93例HCC中MIF、CyclinD1的表達(dá)，分析它們的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)MIF和Cyclin D1mRNA和蛋白觀察10例新鮮肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：免疫組化結(jié)果表明，組織芯片

7、93例HCC中MIF、CyclinD1表達(dá)率分別為71％、41％。MIF和CyclinD1陽性表達(dá)率與正常肝臟組織（均為陰性）表達(dá)率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在≥3.5cm的腫瘤中MIF表達(dá)率為79％，明顯高于在小于3.5cm腫瘤中的表達(dá)率48％（P＜0.01）；有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中CyclinD1陽性率62％，明顯高于無轉(zhuǎn)移病例中陽性率35％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MIF表達(dá)強(qiáng)弱與CyclinD1明顯正相關(guān)（P

8、＜0.01）。
　　 MIF和Cyclin D1 mRNA在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為癌旁組織的7.31±1.85倍和4.27±1.05倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FMIF=111.4，P＜0.01；FCyclinD1=58.4，P＜0.01）。MIF和CyclinD1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)量明顯高于與癌旁組織，MIF和CyclinD1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)分別比癌旁組織高3.6±0.80倍和2.3±0.10倍（FMIF=15.5，

9、P＜0.01；FCyclinD1=87.5，P＜0.01）。
　　 結(jié)論： MIF和 CyclinD1蛋白及其mRNA在HCC中高表達(dá)。MIF的表達(dá)與CyclinD1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示MIF、CyclinD1在HCC發(fā)展進(jìn)程中可能起共同促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。
　　 第二部分小RNA干擾MIF基因表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和生長(zhǎng)
　　 目的：研究特異性小干擾RNA（MIF siRNA）對(duì)肝癌細(xì)胞MIF基

10、因表達(dá)的抑制作用，以及MIF基因表達(dá)下降對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。
　　 方法：脂質(zhì)體方法將化學(xué)合成的MIF siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞PLC、HepG2。定量RT-PCR、Western blot檢測(cè)MIF mRNA和蛋白的表達(dá)。四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法、體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖和對(duì)重組基底膜(matrigel)穿透能力。裸鼠皮下種植siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞PLC，觀察腫瘤結(jié)節(jié)形成和增長(zhǎng)情況至術(shù)后第20天。
　　

11、 結(jié)果：50nmol/L的MIF siRNA使PLC和HepG2細(xì)胞的MIF mRNA表達(dá)下調(diào)60.6％和72.1％，蛋白水平降低59.74％和64.84％。100 nmol/L的MIF siRNA使PLC和HepG2細(xì)胞的MIF mRNA表達(dá)下調(diào)81.3％和89.1％，蛋白水平降低69.50％、72.31％，與對(duì)照組相比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均<0.01）。100 nmol/L MIF siRNA轉(zhuǎn)染24hr后PLC和HepG2細(xì)

12、胞MIF免疫熒光明顯減弱，MIF表達(dá)水平明顯下降；細(xì)胞增殖率分別下降16.79％和47.14％（p均<0.05）。穿透matrigel的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較分別下降41.38％和40.63％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均<0.05）。實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤明顯比對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢，第7起發(fā)現(xiàn)腫瘤大小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：MIF siRNA能有效抑制MIF表達(dá)及肝癌細(xì)胞增殖、遷移和生長(zhǎng)。
　　 第三部分 siRNA阻斷MIF表達(dá)抑制

13、肝癌增殖和遷移的分子機(jī)制
　　 目的：研究探討特異性MIF siRNA抑制細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖和遷移的可能作用機(jī)制。
　　 方法：化學(xué)合成與MIF mRNA匹配的siRNA雙鏈，脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞PLC、HepG2等。Realtime-PCR檢測(cè)CyclinD1mRNA水平和 MIFmRNA水平的變化趨勢(shì)。 Western blot檢測(cè)ERK、AKT、GSK3β信號(hào)傳導(dǎo)通路和CyclinD1、CDK4、CDK6以及基質(zhì)

14、金屬蛋白酶-2（MMP-2）等相關(guān)的分子表達(dá)的改變。免疫印跡驗(yàn)證4對(duì)HCC癌組織和癌旁組織的磷酸化ERK（p-ERK）水平
　　 結(jié)果：MIF siRNA轉(zhuǎn)染PLC和HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，CyclinD1mRNA水平伴隨MIFmRNA水平的下降而下調(diào)，western blot結(jié)果提示CyclinD1在MIF siRNA轉(zhuǎn)染濃終度為100nM時(shí)表達(dá)下調(diào)69.4％ 81.7％。100nM MIF siRNA轉(zhuǎn)染PLC和HepG2