HSPA12A mRNA、Eml5和HSPBAP1在耐藥性癲癇患者腦組織中的表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究耐藥性癲癇患者腦組織中差異基因及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá),并探討其在耐藥性癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。 材料和方法:從我科建立的耐藥性癲癇患者術(shù)后腦組織庫中隨機(jī)抽取顳葉26例,海馬10例作為本次研究的實(shí)驗(yàn)組。其中男性19例,女性17例;年齡8-47歲,平均年齡21.88+9.62((x)±S)歲;病程2.5~30年,平均10.24+6.83((x)iS)年。部分繼發(fā)全身強(qiáng)直.陣攣性發(fā)作l7例,復(fù)雜部分性發(fā)作9例,多種發(fā)作形式10例(

2、強(qiáng)直性發(fā)作,單純部分性發(fā)作)。對照組8例,全部系來自顱腦外傷清創(chuàng)患者或意外死亡尸檢者的相對正常腦組織,納入的受試者無癲癇病史及其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病史,且病理切片證實(shí)腦組織結(jié)構(gòu)正常。其中顳葉5例,海馬3例;男4例,女4例,年齡17-66歲,平均31.59±11.65((x)±S)歲。 實(shí)驗(yàn)組和對照組腦組織取出后部分立即放入液氮(一196℃)中冷凍保存,用于基因芯片掃描、熒光定量PCR(nuorescencequantitati

3、vepolymerasechainreaction,F(xiàn)Q-PCR)和Westernblot分析;部分置于4%多聚甲醛固定48h,隨后常規(guī)石蠟包埋切片,常溫保存用于免疫組化染色。先用含有4096個人類靶基因的基因芯片對差異表達(dá)的基因進(jìn)行檢測,篩選出候選基因棘皮動物微管結(jié)合蛋白類似蛋白5mRNA(echinodermmicrotubuleassociatedproteinlike5mRNA,Eml5mRNA.GenBank:NM183387

4、),熱休克蛋白27相關(guān)蛋白1mRNA(heatshook27kDaassociatedprotein1mRNA,HSPBAPlmRNA.(_ienl3ank:AK096705)和熱休克蛋白70相關(guān)蛋白12AmRNA(heatshock70kDaprotein12AmRNA,HSPAl2AmRNA.GenBank:XM_048898)后,用FQ-PCR,免疫組化和Westernblot對芯片掃描結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果: 1總

5、RNA抽提及質(zhì)檢結(jié)果:兩組總RNA分別為279pg、275llg,總RNA的A260/A280比值分別為1.821、1.904,都位于1.8-2.2之間;電泳圖譜有清晰的條帶,70~C水浴保溫1h后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜未見明顯改變,提示兩樣品總RNA質(zhì)檢合格。 2基因芯片:對含有4096個人類靶基因的基因芯片進(jìn)行掃描,共檢測出142條相關(guān)基因存在差異表達(dá),其中104條表達(dá)上調(diào),38條表達(dá)下調(diào)。其中候選基因Eml5mRNA

6、,HSPBAPlmRNA和HSPAl2AmRNA的Cy5/Cy3比值分別為3.741、4.845和2.44l。 3FQ-PCR:樣品的三個孔道實(shí)時熒光曲線值基本擬合,CT(thresholdcycle)值接近,檢測結(jié)果顯示Eml5mRNA,HSPBAPlmRNA和HSPAl2AmRNA在耐藥性癲癇腦組織中的表達(dá)量均高于正常對照組。 4免疫組化:發(fā)現(xiàn)Eml5和HSPBAPl蛋白在耐藥性癲癇顳葉和海馬中高表達(dá),與對照組相同部

7、位的光密度(opticaldensity,OD)值比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 5Westernblot:耐藥性癲癇顳葉和海馬中Eml5和HSPBAPl的蛋白表達(dá)量均高于相同部位的對照組。 結(jié)論: 1基因芯片在篩選耐藥性癲癇相關(guān)差異基因表達(dá)時,具有快速、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)。通過基因芯片技術(shù)對耐藥性癲癇患者術(shù)后腦組織差異表達(dá)基因的測定,可為耐藥性癲癇的發(fā)病機(jī)制從基因水平上提供依據(jù)。 2基因

8、水平和蛋白水均證實(shí)Eml5和HSPBAPl在耐藥性癲癇患者腦組織中的表達(dá)量高于對照組。HSPAl2AmRNA在耐藥性癲癇腦組織中的表達(dá)量高于對照組,F(xiàn)Q-PCR與基因芯片結(jié)果一致。 3耐藥性癲癇的主要病理改變是海馬苔蘚纖維發(fā)芽,Eml5蛋白表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)神經(jīng)元樹突和軸突延伸,觸發(fā)海馬苔蘚纖維發(fā)芽,最終導(dǎo)致病理性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組和興奮性突觸重構(gòu)。 4耐藥性癲癇患者腦組織中HSPBAPl的高表達(dá)可能抑制了熱休克蛋白27(hea

9、tshockprotein27,HSP27)的神經(jīng)元保護(hù)功能,促進(jìn)細(xì)胞色素C-caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程;激活Fas介導(dǎo)的依賴Daxxf一種Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白)的JNK/SAPK信號傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。HSPBAPl阻礙了磷酸化HSP27對肌動蛋白聚合作用的抑制,間接加強(qiáng)了微絲組裝,觸發(fā)海馬苔蘚纖維發(fā)芽。 5HSPAl2AmRNA表達(dá)上調(diào)可能在耐藥性癲癇發(fā)病機(jī)制中起重要作用,我們認(rèn)為HSPAl2A可能作為重

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