倍半萜烯內(nèi)酯類化合物對晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞炎癥因子調(diào)控的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 糖尿病腎病(diabetic ncphrophthy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)危害性最大的慢性并發(fā)癥之一。 DN病理改變的特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分積聚所致的腎小球肥大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增寬，最后發(fā)展為腎小球硬化。在外界刺激下，系膜細(xì)胞會迅速發(fā)生表形變化，并可分泌多種生長因子，如血小板衍生因子、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞

2、生長因子，單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）。這些炎癥因子能夠招募炎癥細(xì)胞，增加細(xì)胞外基質(zhì)積聚，其中MCP-1起到了關(guān)鍵的作用，被認(rèn)為是腎疾病發(fā)病機(jī)理的一種主要趨化因子。
　　 DN的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，在導(dǎo)致DN的眾多原因中，現(xiàn)普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激是造成糖尿病腎病各種損害的主要原因。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advancedoxidation protein prod

3、ucts，AoPPs)是Witko.Sarsat在慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)病人血漿中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)產(chǎn)物。它是由中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶催化活性氧生成的次氯酸作用于蛋白質(zhì)而形成的。AoPPs主要在CRF患者中出現(xiàn)，不過有學(xué)者證實了在糖尿病患者血液中也有AOPPs的升高，同時發(fā)現(xiàn)肥胖患者也存在AOPPs升高，這表明AOPPs可能參與了糖尿病腎病的形成。最近有研究表明，AOPPs能夠通過活化蛋白

4、激酶C后通過NADPH氧化酶誘導(dǎo)系膜細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，促使系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor，NF-κB)等是氧化應(yīng)激敏感的信號，主要參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，與炎癥性疾病的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，可促使腎內(nèi)炎癥反應(yīng)。
　　 小白菊內(nèi)酯

5、(parthenolide，PTL)是從feverfew(Tanacetum parthenium)純化出的一種倍半萜烯內(nèi)酯類化合物，是被證實為藥理活性最好的成分。它曾被用于治療發(fā)熱、偏頭痛、哮喘及關(guān)節(jié)痛等。而它的功效遠(yuǎn)不止這些，很多實驗表明小白菊內(nèi)酯是一種特異且強(qiáng)有效NF-κB抑制劑，通過直接阻止NF-κB和（或）作用于IKK復(fù)合體，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化、炎癥、腫瘤作用。在這個實驗中，我們以PTL等化合物為原料合成了一系列倍半萜烯內(nèi)酯類

6、化合物，研究了其構(gòu)-效關(guān)系。
　　 本研究以體外的系膜細(xì)胞為對象，觀察人工合成的晚期蛋白氧化產(chǎn)物是否能夠激活MAPKs/NF-κB信號通路和上調(diào)炎癥因子MCP-1的表達(dá)，以及被激活的NF-κB和MCP-1能否被倍半萜烯內(nèi)酯類化合物抑制，更重要的是通過與小白菊內(nèi)酯比較觀察我們研制的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物的藥效。
　　 研究內(nèi)容與方法：
　　 1、AOPPs的制備
　　 將20mg/ml大鼠白蛋白與40mmo/

7、l次氯酸等體積混合，室溫放置30分鐘，其摩爾比為1∶140(RSA-次氯酸)。制備的AOPP在無內(nèi)毒素PBS中透析24小時，除去游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20mg/mlRSA與PBS等體積混合，作為對照。AOPPs含量通過測定酸性條件下340nm的吸光度，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得。通過鱟試驗法檢測，該方法制備的AOPPs內(nèi)毒素含量均低于0.25EU/ml。
　　 2、大鼠系膜細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 大

8、鼠腎小球系膜細(xì)胞(HYBZ-1)購自武漢細(xì)胞庫。細(xì)胞復(fù)蘇后在37℃、5％CO2條件下用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70-80％融合時用于實驗。
　　 3、AOPPs對細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的影響
　　 MCs生長至融合，分別與濃度為0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs和200(μg/ml)未經(jīng)修飾的RSA共同孵育，于24小時后收集細(xì)胞上清。ELISA法檢測MCP-

9、1在細(xì)胞上清中的濃度。
　　 4、AOPPs對單核細(xì)胞趨化蛋白-1mRNA(MCP-1 mRNA)表達(dá)的影響
　　 MCs分別與濃度為0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200(μg/ml)未經(jīng)修飾的RSA共同孵育24小時后，收集細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按試劑盒說明進(jìn)行操作，RT-PCR測定MCP-1mRNA表達(dá)。
　　 5、AOPPs對細(xì)胞內(nèi)p47phox的膜遷移的影響

10、>　　 MCs分別與濃度為0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200(μg/ml)未經(jīng)修飾的RSA共同孵育1小時后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞漿和細(xì)胞膜蛋白。按試劑盒說明進(jìn)行操作，Western blot檢測每組細(xì)胞漿內(nèi)p47phox蛋白的表達(dá)和膜內(nèi)p47phox蛋白的表達(dá)。
　　 6、AOPPs對細(xì)胞內(nèi)MAPKs信號通路的影響
　　 MCs分別與濃度為0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200

11、(μg/ml)未經(jīng)修飾的RSA共同孵育1小時后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。按試劑盒說明進(jìn)行操作，Western blot檢測每組細(xì)胞內(nèi)p-P38、P38、p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白的表達(dá)。
　　 7、AOPPs對細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路的影響
　　 MCs分別與濃度為0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200(μg/ml)未經(jīng)修飾的RSA共同孵育1小時后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋

12、白和細(xì)胞核蛋白。按試劑盒說明進(jìn)行操作，Western blot檢測每組細(xì)胞內(nèi)NF-κB/p65、p-IκBα、IκBα、p-IKKα、IKKα蛋白的表達(dá)和核內(nèi)p-NF-κB/p65蛋白的表達(dá)。8、倍半萜烯內(nèi)酯類化合物對AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞MCP-1的影響
　　 濃度為10（μmol/L）的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物與MCs孵育1小時后，濃度為200(μg/ml)的AOPPs刺激24小時后收集細(xì)胞上清。ELISA法檢測MCP-1在細(xì)胞上

13、清中的濃度。
　　 9、倍半萜烯內(nèi)酯類化合物對AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞MCP-1mRNA的影響
　　 濃度為10(μmol/L)的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物與MCs孵育1小時后，濃度為200(μg/ml)的AOPPs刺激24小時后，收集細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按試劑盒說明進(jìn)行操作，RT-PCR測定MCP-1mRNA的表達(dá)。10、倍半萜烯內(nèi)酯類化合物對AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路激活的影響
　　

14、 濃度分別為5、10(μmol/L)的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物與MCs孵育1小時后，濃度為200(μg/ml)的AOPPs刺激1小時后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。按試劑盒說明進(jìn)行操作，Western blot檢測每組細(xì)胞內(nèi)IκBα蛋白的表達(dá)。
　　 統(tǒng)計方法：
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實驗的結(jié)果，以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。多個樣本均數(shù)的比較采用One Way ANOVA，兩兩比較采用

15、LSD和SNK，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、AOPPs的鑒定
　　 制備的次氯酸修飾的大鼠血清白蛋白和未經(jīng)修飾的大鼠血清白蛋白的蛋白濃度分別為8.52mg/ml和10.3mg/ml，AOPPs含量分別為538.14μmol/l and1.56μmol/l，經(jīng)蛋白濃度矯正后分別為63.16 nmol/mg蛋白和0.15 nmol/mg蛋白。所有制各的AOPP或未經(jīng)修飾的RSA經(jīng)鱟試驗法

16、檢測內(nèi)毒素含量均低于0.25EU/ml。
　　 2、AOPPs對系膜細(xì)胞MCP-1的影響
　　 1) AOPPs對大鼠系膜細(xì)胞MCP-1蛋白分泌的影響
　　 濃度為100、200(μg/ml)的AOPPs與RMCs共同孵育24h時后，細(xì)胞上清中分泌的MCP-1含量上調(diào)，并且隨著AOPPs劑量的增加，上述蛋白表達(dá)亦逐漸增加(p＜0.05)，未經(jīng)修飾的RSA對MCP-1的分泌無明顯影響(p＞0.05)。
　　

17、 1) AOPPs對細(xì)胞細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)的影響
　　 濃度為50、100、200(μg/ml)的AOPPs與RMCs共同孵育24h時后，細(xì)胞內(nèi)的MCP-1mRNA表達(dá)上調(diào)，并且AOPPs以劑量依賴的方式上調(diào)(p＜0.05)。未被修飾的RSA對RMCs表達(dá)MCP-1mRNA無明顯影響(p＞0.05)。
　　 3、AOPPs誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p47phox的膜遷移
　　 濃度為50、100、200(μg/ml)的A

18、OPPs與RMCs共同孵育1h時后，細(xì)胞漿內(nèi)的p47phox隨著AOPP的濃度逐漸上升而下降(p＜0.05)，細(xì)胞膜內(nèi)的p47phox隨著AOPPs的濃度逐漸上升而升高(p＜0.05)。未被修飾的RSA對RMCs內(nèi)p47phox的膜遷移無明顯影響(p＞0.05)。
　　 4、AOPPs對細(xì)胞內(nèi)MAPKs信號通路的激活
　　 濃度為50、100、200(μg/ml)的AOPPs與RMCs共同孵育1h時后，細(xì)胞內(nèi)的磷酸化P3

19、8、JNK和ERK1/2的表達(dá)量隨著AOPPs的濃度逐漸上升而升高(p＜0.05)，而細(xì)胞內(nèi)總的P38、JNK和ERK1/2的蛋白表達(dá)量不變。未被修飾的RSA對RMCs內(nèi)P38、JNK和ERK1/2的磷酸化表達(dá)量無明顯變化。
　　 5、AOPPs對細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路的激活
　　 濃度為50、100、200(μg/ml)的AOPPs與RMCs共同孵育1h時后，細(xì)胞內(nèi)的磷酸化IκBα、磷酸化IKKα蛋白的表達(dá)和核內(nèi)p-

20、NF-κB/p65蛋白表達(dá)量隨著AOPPs的濃度逐漸上升而升高(p＜0.05)，而細(xì)胞內(nèi)總的IKKα、NF-κB/p65的蛋白表達(dá)量不變，總的IκBα隨著AOPPs的濃度逐漸上升而被降解(p＜0.05)，未被修飾的RSA對RMCs內(nèi)IκBα、IKKα、NF-κB/p65的磷酸化表達(dá)量無明顯變化。
　　 6、倍半萜烯內(nèi)酯類化合物抑制AOPPs誘導(dǎo)的MCP-1
　　 濃度為10(μmol/L)的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物與MCs孵

21、育1小時后，AOPPs200(μg/ml)刺激24小時，Elisa檢測細(xì)胞上清MCP-1的表達(dá)量，細(xì)胞上清中分泌的MCP-1含量明顯下調(diào)(p＜0.05)。
　　 7、倍半萜烯內(nèi)酯類化合物抑制AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞MCP-1mRNA
　　 濃度為10（μmol/L）的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物與MCs孵育1小時后，濃度為200(μg/ml)的AOPPs刺激24小時，RT-PCR檢測細(xì)胞MCP-1mRNA的表達(dá)量，細(xì)胞內(nèi)的MCP-1

22、mRNA含量明顯下調(diào)(p＜0.05)。
　　 8、倍半萜烯內(nèi)酯類化合物對AOPPs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路激活的影響
　　 濃度為5和10(μmol/L)的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物與MCs孵育1小時后，濃度為200(μg/ml)的AOPPs刺激1小時，Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)IκBα蛋白的表達(dá)量，細(xì)胞內(nèi)總的IκBα的降解被抑制(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 AOPPs能夠快速誘導(dǎo)大鼠系