芥菜籽在保護肝臟脂肪樣變中的作用機制.pdf

1、背景目的:
　　 非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝細胞脂肪聚集、肝小葉炎癥細胞浸潤、氣球樣變?yōu)樘卣鞯母闻K功能失調性病變。它包括單純性脂肪肝及由其演變的非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)和NASH相關性肝纖維化、肝硬化，甚至發(fā)展為肝細胞癌。NAFLD可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，原發(fā)性NAFLD主要與代謝綜合征(

2、metabolic syndrome，MS)有關，而繼發(fā)性NAFLD則由病毒性肝炎、藥物、空回腸短路等外科手術以及長期靜脈內營養(yǎng)等多種原因引起。近幾年來，脂肪肝的發(fā)病率呈上升趨勢，已成為發(fā)達國家慢性肝病的首要原因。
　　 目前對于NAFLD發(fā)病機制占主流地位的是最早由Day和James[3]在1998年提出的“二次打擊學說”。初次打擊主要是指胰島素抵抗和脂質代謝紊亂導致的肝細胞脂質沉積，形成單純性脂肪肝，二次打擊主要是指各種原因

3、所致的氧化應激及脂質過氧化損傷，引起非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。若NASH持續(xù)存在，便可進一步發(fā)展為脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化，甚至是肝癌。
　　 脂肪肝是一種多病因引起的獲得性疾病，因此，積極尋找并去除可能的病因和誘因，防治原發(fā)病或相關危險因素，積極成功的戒酒是防治脂肪肝最有效的措施，改變生活方式以及治療伴發(fā)病和相關危險因素是整體治療的基本前提，合理膳食、中等量有氧運動、糾正不良生活方式是改善脂肪肝的有效方式。
　

4、　 芥菜籽為十字花科蕓苔屬植物的種子，近年來研究發(fā)現(xiàn)，芥菜籽中含有異硫氰酸酯、芥酸、酚類物質、多糖等多種化學成分，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化等多種生理功能。異硫氰酸酯(ITCs)能誘導Ⅱ相水解酶的生成，從而抑制體內氧化過程。我們在與兩種已知的抗氧化劑（白梨露醇酐、云芝多糖）的比較試驗中證實:芥菜籽具有更有效的提高抗氧化酶(SOD)水平以及抑制巨噬細胞呼吸爆發(fā)和脂質過氧化的作用。
　　 本研究采用高脂飲食的非酒精性脂肪肝模型為

5、研究對象，應用芥菜籽及其提取物，通過體外和體內動物實驗，探討在高血脂條件下，抗氧化劑保護肝臟損害，調節(jié)免疫應答，以及調節(jié)上述肝細胞脂肪代謝影響因子的表達與活性等方面，驗證芥菜籽提取物在高血脂條件下的預防肝細胞脂肪樣變的功能，探討NAFLD的發(fā)病機制，并驗證芥菜籽的預防作用。為芥菜籽應用于非酒精性脂肪肝防治的可行性探討奠定基礎。
　　 材料和方法:
　　 1.體外實驗部分:用Ox-LDL誘導HepG2細胞脂肪樣變，實驗分為

6、5組:(1)正常對照組(normal control group);(2)脂肪樣變模型組(ox-LDL);(3)ox-LDL+p38通路阻斷劑(ox-LDL+SB);(4)ox-LDL+ERK通路阻斷劑(ox-LDL+PD);(5) ox-LDL+JNK通路阻斷劑(ox-LDL+SP)。
　　 體內實驗部分:建立高脂誘發(fā)小鼠肝脂肪變性模型:選取60只ApoE-/-小鼠，隨機均分為5組，高脂食物喂養(yǎng)25周。分組如下:(1)正常對照

7、組(Normalcontrol);(2)高脂飲食組(HF only);(3)芥菜籽飲食組(7.5％MS only)(4)低劑量干預組(HF+5％MS);(5)高劑量干預組(HF+7.5％MS)。從實驗第2周開始，高脂飲食組、低劑量干預組、高劑量干預組小鼠連續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料至實驗結束，正常對照組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，芥菜籽飲食組給與7.5％MS的飲食，低劑量干預組和高劑量干預組在給與高脂飲食的同時分別給予含5％和7.5％芥菜籽的飼料喂養(yǎng)直至25周實

8、驗結束時。
　　 2.觀察各組小鼠的一般狀態(tài)，如攝食及飲水情況、營養(yǎng)狀況、體重、活動狀態(tài)、毛色、光澤度變化等方面的改變情況。實驗25周時處死小鼠，留取血漿、脾臟、肝臟。
　　 3.肝臟常規(guī)固定脫水，石蠟包埋切片，H.E染色觀察，確定肝臟病理組織學改變情況。
　　 4.流式細胞(FCM)術檢測各組小鼠脾臟中CD4+、CD25+、CD8+、CD11c+細胞的比率。
　　 5.運用多功能液相芯片分析系統(tǒng)(lum

9、inex200)檢測各組小鼠血漿中的IL-5、IL-12、IFN-γ的含量。
　　 6.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測小鼠血漿中脂聯(lián)素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)、TNF-α含量的變化，并檢測總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)含量的變化。
　　 7.流式細胞(FCM)術觀察Ox-LDL誘導的HepG2細胞脂肪樣變后

10、MAPK通路的變化。
　　 結果:
　　 1.實驗終末期，高脂飲食組小鼠出現(xiàn)毛色偏黃，精神萎靡，各組活動度好，實驗期間各組小鼠均未出現(xiàn)腹瀉及大便異常。
　　 2.實驗結束后觀察肝臟組織病理切片，結果顯示，給與芥菜籽干預組的小鼠較高脂飲食組小鼠的肝臟，細胞脂肪樣變程度減輕，且7.5％MS干預組比5％MS干預組小鼠作用更明顯，而給與單純7.5％MS飲食的小鼠肝臟，與對照組小鼠肝臟組織無明顯差別。
　　 3.7

11、.5％MS組、5％MS干預組、7.5％MS干預組和正常對照組小鼠脾臟中CD11 c+CD45RB+細胞的比率分別為1.89±0.91％、3.13±0.32％、2.03±0.23％、1.64±0.72％，HF組為4.22±0.36％，各實驗組之間比較差異有顯著性(P=0.000)，其中7.5％MS干預組和正常對照組小鼠脾臟中CD11 c+CD45RB+細胞比率與HF組相比均降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 4.各組小鼠

12、脾臟中CD4CD25陽性細胞比率經統(tǒng)計學比較差異有顯著性(P=0.000)，其中7.5％MS干預組和7.5％MS組小鼠脾臟中CD4+CD25+細胞比率為46.93±5.99％、49.00±4.71％，與HF組（24.10±3.23％）相比升高，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 5.各組小鼠脾臟中CD4單陽性細胞與CD8單陽性細胞比值經統(tǒng)計學比較差異有顯著性(P=0.000)，其中正常對照組、7.5％MS組、5％MS干預組和7

13、.5％MS干預組小鼠脾臟中CD4+/CD8+值分別為1.98±0.79、1.92±0.93、1.88±0.81和1.96±0.69，與HF組的1.73±0.13相比升高，差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 6.各組小鼠血漿中IL-5的含量經統(tǒng)計學比較差異有顯著性(P=0.000)，其中正常對照組和7.5％MS組小鼠血漿中IL-5的含量為266.88±56.98pg/ml、207.17±36.41pg/ml，與HF組的16.79

14、±7.25pg/ml相比增加，差異有顯著性(P＜0.01)，7.5％MS干預組小鼠血漿中IL-5含量為158.64±45.76，與HF組相比差異有顯著性(P＜0.01);各組小鼠血漿中IL-12和IFN-γ的含量經統(tǒng)計學比較差異均有顯著性（P IL-12=0.001;PIFN-a=0.000），其中IL-12和IFN-γ的含量在7.5％MS干預組小鼠血漿中分別為385.65±67.42pg/ml和43.49±6.32 pg/ml，與HF

15、組的1555.14±255.90 pg/ml和178.87±16.50 pg/ml相比明顯減少，差異有顯著性(P＜0.01)。在7.5％MS組中IL-12和IFN-γ的含量分別為:339.50±64.53pg/ml、37.87±6.11 pg/ml，與HF組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 7.各組小鼠血漿中TG、LDL含量有組間差異(P=0.000;P=0.000)，與HF模型組相比含量顯著降低，其中7.5％MS干預

16、組、5％MS干預組、7.5％MS組血漿中LDL含量分別為:0.29±0.004、0.39±0.04、0.021±0.003，與HF模型組（0.077±0.008）相比，LDL含量顯著下降(P＜0.01)，7.5％MS組TG含量為0.11±0.02，與HF模型組（0.83±0.93）相比，差異有顯著性(P＜0.01);各組小鼠血漿HDL含量有差異(P=0.000)，7.5％MS組、5％MS干預組及7.5％MS干預組小鼠血漿中HDL含量分別

17、為:0.053±0.01、0.029±0.01、0.055±0.01，與HF模型組（0.024±0.01）相比顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而各組小鼠血漿中總膽固醇含量無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 8.對脂肪因子的檢測顯示，各組小鼠血清中瘦素(Leptin)的含量經統(tǒng)計學比較差異有顯著性(P=0.000)，其中7.5％MS組及對照組小鼠血清Leptin水平分別為0.035±0.006和0.020±0.008

18、，與HF模型組(0.075±0.07)相比，差異有顯著性(P＜0.01);各組小鼠血清抵抗素(Resisitin)含量有統(tǒng)計學差異(P=0.000)，其中7.5％MS組、7.5％MS干預組和正常對照組含量分別為:0.045±0.006、0.054±0.007和0.041±0.004，與HF模型(0.106±0.172)相比，含量顯著下降(P＜0.05);各組小鼠血清脂聯(lián)素(Adiponectin)含量差異有統(tǒng)計學意義(p=0.000)，

19、其中7.5％MS組、7.5％MS干預組和正常對照組含量分別為:0.082±0.007、0.059±0.010和0.083±0.009，與HF模型組(0.236±0.06)相比，含量顯著增加(P＜0.05);各組小鼠血清中TNF-α含量有差異(p=0.000)，其中7.5％MS組、7.5％MS干預組和正常對照組含量分別為:0.022±0.008、0.035±0.008和0.024±0.006，與HF模型組(0.074±0.009)相比，含

20、量顯著下降(P＜0.05)。
　　 9.細胞實驗結果表明，Ox-LDL誘導的HepG2細胞脂肪樣變可能與ERK-MAPK通路有關，根據(jù)流式細胞術結果表明，加入ERK通路抑制劑后，脂肪樣變的細胞比例明顯減少，而加入p38和JNK的抑制劑則無此現(xiàn)象。
　　 結論:
　　 1.芥菜籽對高脂飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝具有預防作用，能明顯降低肝細胞脂肪樣變的發(fā)生，隨著芥菜籽濃度的增加，其預防脂肪肝發(fā)生的作用明顯增強。

21、r>　　 2.芥菜籽預防小鼠脂肪肝作用機制與ERK-MAPK通路有關。
　　 3.在高脂飲食誘導脂肪肝形成過程中，芥菜籽能降低小鼠血漿中TG、LDL水平，升高HDL水平，但不改變總膽固醇含量;降低小鼠血漿中瘦素、抵抗素、TNF-α水平，增加脂聯(lián)素表達水平;提高實驗小鼠機體CD4/CD8的比例，維持T細胞亞群間的平衡，增強機體免疫功能，提高淋巴細胞活性;提高CD4+CD25+細胞水平，使其介導免疫耐受減輕炎癥反應;糾正高脂飲食引