Caveolin-1在心房顫動心房間質(zhì)纖維化中作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 心房顫動(AtrialFibrillation，AF)，簡稱房顫，是目前臨床上最常見復(fù)雜的心律失常之一。房顫在普通人群中的患病率較高，且隨著年齡的增大而出現(xiàn)增高的趨勢。房顫可以誘發(fā)心功能不全、腦栓塞及周圍血管栓塞，房顫患者死亡率比正常人高出兩倍以上。在我國，隨著人口的老齡化，將來房顫的患病率將大大提高，對患者家庭及社會將造成沉重的負(fù)擔(dān)。盡管如今已經(jīng)明確多種疾病，如冠心病、甲狀腺功能亢進(jìn)和高血壓等，均可以誘發(fā)房顫

2、，但目前關(guān)于房顫發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍未完全明確，這在很大程度上制約了房顫的治療進(jìn)展。
　　 研究認(rèn)為，心房重構(gòu)與房顫的發(fā)生和維持密切相關(guān)。心房重構(gòu)包括心房電重構(gòu)和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。心肌間質(zhì)纖維化作為房顫時(shí)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的一個(gè)重要表現(xiàn)，可以使分隔心肌細(xì)胞造成心房內(nèi)電活動傳導(dǎo)延遲和異常路徑傳導(dǎo)，導(dǎo)致心房內(nèi)電活動傳導(dǎo)的各向異性增加，出現(xiàn)不均一傳導(dǎo)，有利于折返的形成。因此，心肌間質(zhì)纖維化被認(rèn)為在房顫的發(fā)生和維持中起了關(guān)鍵的作用。明確房顫時(shí)

3、心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生的機(jī)制對于房顫機(jī)制的闡明和房顫的更有效治療具有深遠(yuǎn)意義。
　　 小窩是上世紀(jì)50年代首次被發(fā)現(xiàn)的一種存在于細(xì)胞質(zhì)膜上直徑約為50～100nm的燒瓶樣凹陷，具有參與大分子物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多種生物學(xué)功能。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白-1（Cavelin-1）作為小窩的主要構(gòu)成物質(zhì)和標(biāo)志性蛋白，可能參與了調(diào)節(jié)多種涉及組織器官纖維化信號通路的過程。因此我們可以認(rèn)為Cavelin-1與組織器

4、官間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。然而這些研究主要集中在肺組織纖維化、結(jié)締組織病和系統(tǒng)性硬化等疾病，關(guān)于Cavelin-1與房顫心房組織間質(zhì)纖維化的研究目前國內(nèi)外均未見報(bào)道。因此，明確Cavelin-1在房顫時(shí)心肌間質(zhì)纖維化中所扮演的角色，將有利于我們進(jìn)一步了解房顫發(fā)生維持的機(jī)制，從而為房顫的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 研究目的:
　　 (1)觀察Cavelin-1和TGF-β1在風(fēng)濕性心臟病房顫患者心房組織中的表達(dá)水平;
　　

5、 (2)研究TGF-β1對心臟成纖維細(xì)胞Cavelin-1表達(dá)的影響作用，明確兩者的關(guān)系。
　　 研究方法:
　　 選取就診于心臟外科患有風(fēng)濕性心臟病瓣膜疾病擬接受換瓣手術(shù)的患者為研究對象，按照術(shù)前體表心電圖分2組:竇性心律(SR)組和慢性房顫（房顫持續(xù)時(shí)間大于6個(gè)月）(AF)組。在心臟外科換瓣手術(shù)時(shí)，體外循環(huán)插管前及右心房打開后立即獲取患者右心耳組織約300mg。部分組織放入4％甲醛溶液中固定24h后，制作石蠟切片并

6、行Masson染色，評價(jià)心房組織心肌纖維化程度;部分組織行WesternBlot檢測心房組織中TGF-β1、Cavelin-1和膠原Ⅰ、Ⅲ的蛋白表達(dá)情況;部分組織行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，檢測心房組織中TGF-β1和Cavelin-1的mRNA表達(dá)情況。
　　 酶消化法差速貼壁分離培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細(xì)胞。當(dāng)?shù)?～3代接種到6孔板中培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長密度達(dá)到為90％時(shí)，使用人重組TGF-β1細(xì)胞因子進(jìn)行刺激培養(yǎng):以濃度為100

7、ng/ml的人重組TGF-β1作用成纖維細(xì)胞0h，6h，12h，24h和48h，或以0ng/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml和1000ng/ml六種濃度的人重組TGF-β1作用成纖維細(xì)胞48h。提取各實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞蛋白，通過WesternBlot法檢測TGF-β1在時(shí)間梯度和濃度梯度下對心肌成纖維細(xì)胞Caveolin-1蛋白表達(dá)的影響。重復(fù)培養(yǎng)3個(gè)批次的細(xì)胞，每個(gè)批次細(xì)胞重復(fù)試驗(yàn)3次。
　　 研

8、究結(jié)果:
　　 (1)入組研究的患者共計(jì)23例，其中SR組10例，AF組13例。AF組患者的左心房直徑(LAD)較SR組明顯擴(kuò)大（59.41±10.54vs.47.83±4.92，P＜0.01）。
　　 (2)AF組心房組織中膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)、膠原Ⅰ和膠原Ⅲ蛋白表達(dá)水平均明顯高于SR組（P＜0.05）。
　　 (3)與SR組相比，AF組心房組織中Cavelin-1蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低(0.65±

9、0.17vs.1.00±0.14,0.28±0.13vs.1.02±0.20，P勻＜0.05),而TGF-β1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著升高(2.31±0.65vs.1.00±1.78，3.29±1.64vs.1.03±0.27，P均＜0.05)，Cavelin-1表達(dá)水平與TGF-β1表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.34，P=0.00）。
　　 (4)成功培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細(xì)胞，細(xì)胞純度為95％。
　　 1)以10

10、0ng/ml濃度的人重組TGF-β1作用于成纖維細(xì)胞不同時(shí)間顯示:與0h相比，在最初的12h內(nèi)Cavelin-1蛋白表達(dá)出現(xiàn)升高趨勢，且在12h表達(dá)達(dá)到1.40±0.10倍（P=0.00）;培養(yǎng)12h之后Cavelin-1蛋白表達(dá)水平逐漸降低，48h表達(dá)降低為對照組的0.58±0.02倍（P=0.00）。
　　 2)不同濃度的人重組TGF-β1作用于成纖維細(xì)胞48h后發(fā)現(xiàn):與0ng/ml相比，10ng/ml時(shí)Cavelin-1蛋

11、白表達(dá)開始出現(xiàn)明顯降低，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，減少為對照組的0.73±0.23倍(P=0.07)，而隨著濃度增至100ng/ml和1000ng/ml時(shí)，蛋白表達(dá)減少愈加明顯，為對照組的0.65±0.27倍和0.58±0.32倍(P=0.03，P=0.01)。
　　 研究結(jié)論:
　　 (1)房顫患者心房組織中Cavelin-1表達(dá)下調(diào)，與心房間質(zhì)纖維化關(guān)系密切;
　　 (2)TGF-β1呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性顯著抑