腺苷A2A受體在骨髓間充質干細胞治療肝纖維化的機制研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是急性或慢性肝損傷后細胞外基質積聚而形成的，是肝硬化和肝細胞癌（HCC）的共同病理過程，長期的乙型肝炎、丙型肝炎感染、酒精性肝炎和膽道疾病等都會引起肝纖維化。最近的證據(jù)表明，巨噬細胞、成纖維細胞、膽管細胞，內(nèi)皮細胞在肝纖維化的形成中也可起到關鍵作用，然而其潛在的機制仍沒有研究清楚。近幾年，乙型肝炎的治療研究取得了明顯的進步，與之相關的大量臨床證據(jù)表明，肝纖維化是可逆的。目前，關于間充質干細胞（MSCs）治療各種

2、疾病的報道越來越多。這些細胞不僅可以為其他干細胞提供合適的微環(huán)境，還可以分化為多種間質來源的細胞，包括脂肪、骨、軟骨。作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，間充質干細胞具備抗凋亡、抗炎和促增殖的特性，這是治療肝臟疾病的理想特性。此外，間充質干細胞還具有潛在的緩解炎癥和損傷的功能。過去的研究已經(jīng)描述了MSCs的負向免疫調(diào)節(jié)效應與調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）和Th17細胞密切相關，提示Th17細胞的增多和/或Treg細胞的缺乏與肝纖維化發(fā)病機制相關。然而，

3、對于肝纖維化，很少有研究人員在骨髓間充質干細胞和T細胞的上述作用機制中做過深入研究。作為一種內(nèi)源性嘌呤核苷，腺苷介導多種生理功能通過4個細胞表面受體（A1、A2A，A2B和A3）。A2A受體（A2AR）是一個鳥苷結合蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族和重要的藥物靶點，與治療癌癥、炎癥、鐮狀細胞病、缺血再灌注損傷、感染性疾病、糖尿病腎病、神經(jīng)障礙等密切相關。以往的研究報道，A2AR的激活能減少中性粒細胞并減輕由哮喘、急性肺損傷、關節(jié)炎和炎癥性腸

4、病引起的炎癥。值得注意的是，最近有一些研究表明，胞外腺苷的分泌物及其信號通過腺苷受體（ARS）在多種纖維化疾病的發(fā)病機制中起著舉足輕重的作用。作為一種間充質干細胞，骨髓間充質干細胞（BMSCs）具有相似的特點，而且已經(jīng)有許多研究報道了BMSCs在肝纖維化中的應用，這也是我們選擇BMSCs來進行我們實驗的原因。在實驗中，我們的目標是提供更多關于BMSCs治療肝纖維化的證據(jù)，但進一步的研究仍然是必要的。
　　方法：
　　在決定造

5、模方案后，取200只C57BL/6小鼠，進行肝纖維化造模。腹腔注射CCl4和植物油的混合物（2:3（v/v））（2ml／kg體重），一周兩次，總共12周，取最終存活下來的18只小鼠用于拮抗劑濃度的摸索，分為A2A受體拮抗劑的用量分別為0.05mg/kg，0.1 mg/kg和0.2mg/kg。最終確定濃度為0.1 mg/kg后，取18只存活的小鼠分成四組，即生理鹽水(NS)組、拮抗劑(AA)組、干細胞+拮抗劑(BM+AA)組和干細胞(BM

6、)組，我們先給生理鹽水組和拮抗劑組小鼠尾經(jīng)脈注射1ml生理鹽水，給干細胞+拮抗劑組和干細胞組注射1ml總共含106個細胞數(shù)的骨髓間充質干細胞。然后再給生理鹽水組和干細胞組腹腔注射1ml生理鹽水，給拮抗劑組和干細胞+拮抗劑組注射1ml稀釋過的A2A受體拮抗劑。14天后，先用水合氯醛麻醉小鼠，然后處死小鼠，取肝臟、脾臟和血液進行HE染色、Masson染色、流式分析、PCR、WB和Elisa的檢驗。
　　結果：
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7、染色顯示大量肝細胞腫脹壞死，炎性細胞浸潤，Masson染色顯示纖維組織增生，肝臟小葉結構紊亂，證明造模成功。當小鼠用A2A受體拮抗劑處理后，假小葉形成更加明顯，而用干細胞處理后，肝纖維化程度對比生理鹽水組有很大程度的好轉，且在拮抗劑的基礎上加干細胞，纖維化狀態(tài)也有好轉。⑵Th17的百分比由高到低分別為拮抗劑組、生理鹽水組、干細胞+拮抗劑組和干細胞組，結果和IL-6、TNF-ɑ和IL-17的量一致，而Treg的結果剛剛相反，差異均具有統(tǒng)計

8、學意義。⑶Foxp3基因的表達量隨著干細胞的注射相比生理鹽水組有所上調(diào)，而在注射了A2A受體拮抗劑后下調(diào)，Rorc基因的表達量和Foxp3基因相反。A2AR基因的表達量隨著注射干細胞后上調(diào)。在蛋白層面上， Foxp3、Rorc和A2AR的蛋白表達量與PCR結果相符。
　　結論：
　?、俑杉毎委熌芫徑飧卫w維化，A2A受體拮抗將加重肝纖維化。②干細胞改善肝纖維化的同時，Th17細胞下調(diào)，Treg細胞上調(diào)，A2A受體拮抗時相反。