不同途徑移植MSCs聯(lián)合小間隙吻合法修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的實驗研究.pdf

1、第一部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴增的方法，并探討其生物學(xué)特性。
　　方法：無菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，用L-DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞，離心，去上清，重懸，計數(shù)后，置于含10％FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、5％C02環(huán)境下進行培養(yǎng)，應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進行純化。待細(xì)胞達(dá)90％融合時，胰酶消化2~3min后進行傳代。倒置顯微鏡

2、下觀察原代及傳代后的細(xì)胞生長特點。用計數(shù)法繪制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線，從而進一步了解其生長特性。通過流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞鑒定。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)顯示24h后即可看到有少許細(xì)胞貼壁，剛貼壁的MSCs仍保持圓形，48h貼壁細(xì)胞增多，開始呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，伸突，呈短梭形、三角或多角形。最初2~5天細(xì)胞增殖較慢，呈克隆樣生長，細(xì)胞向四周伸展。第6~9天時細(xì)胞集落迅速增多，呈旋渦狀，并向周圍不斷擴大，原代培養(yǎng)12~15天，細(xì)胞8

3、0~90％融合，即可以傳代。一般情況下傳至第4、5代可獲得形態(tài)均一、增長旺盛的 BMSCs純化細(xì)胞。P2、P4、P6細(xì)胞生長曲線基本相同，分為潛伏期(第1~2天)、對數(shù)生長期(第3-5天)和平臺期(第6~7天)，且?guī)状?xì)胞間生長狀況穩(wěn)定。取生長狀態(tài)良好的第5代BMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行表面抗原標(biāo)志物鑒定的結(jié)果顯示：CD90(98.9％)、CD29（93.7%）陽性，CD34(0.8％)、CD45(1.3％)陰性。
　　結(jié)論：應(yīng)

4、用全骨髓培養(yǎng)結(jié)合貼壁分離法能夠在體外簡單、快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并使其在體外迅速得到增殖，且性狀穩(wěn)定。
　　第二部分不同途徑移植MSCs聯(lián)合小間隙吻合法修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的實驗研究
　　目的：設(shè)計在小間隙吻合法修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的基礎(chǔ)上，通過不同途徑移植BMSCs，觀察其對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)效果，尋找治療周圍神經(jīng)損傷的有效治療方法。
　　方法：采用清潔級健康成年雄性SD大鼠36只，體重250g左右，經(jīng)小間隙

5、吻合法制成周圍神經(jīng)損傷修復(fù)模型后，隨機分成3組，每組12只。對照組即小間隙吻合組（CG），實驗組分為尾靜脈移植BMSCs組（VG）和腓腸肌移植BMSCs組（GG）。各組大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)經(jīng)銳刀切斷后，均行小間隙吻合法修復(fù)（2.0 mm神經(jīng)小間隙）。對照組大鼠術(shù)后不做特殊處理。VG，GG術(shù)后一周移植BrdU陽性的第5代BMSCs。通過一般狀態(tài)、光鏡下大體形態(tài)、坐骨神經(jīng)指數(shù)、運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)、腓腸肌濕重恢復(fù)率、神經(jīng)透射電

6、鏡的超微結(jié)構(gòu)觀察比較三組大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：○1實驗組大鼠術(shù)后足部潰瘍發(fā)生率較對照組低，且肢體恢復(fù)自主活動的時間較對照組早；○2各組大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)逐漸恢復(fù)，術(shù)后4周、8周、12周各組大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)都有不同程度的恢復(fù)，4周時CG組與VG組、VG組與GG組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），CG組與GG組具有顯著差異（p<0.01）；8周時CG組與VG組、CG組與GG組具有顯著差異（p<0.01），VG組與GG組差

7、異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；12周時3組兩兩相比均有顯著差異（p<0.01）；○3術(shù)后各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度都有不同程度的恢復(fù)，GG組恢復(fù)程度較CG組、VG組好，VG組又優(yōu)于CG組；4周、12周時3組兩兩相比均有顯著差異（p<0.01）；○4術(shù)后4周、12周各組大鼠均可見到腓腸肌較對側(cè)正常有萎縮，GG組萎縮程度較CG組與VG組輕，后兩者腓腸肌萎縮程度相當(dāng)。4周、12周CG組與VG組腓腸肌濕重恢復(fù)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.255

8、,P=0.329）；4周、12周CG組與GG組，VG組與GG組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均<0.05）；○5術(shù)后4周組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測顯示：實驗組大鼠神經(jīng)纖維的排立、走形、分布較對照組好，其中GG組又較VG組好；實驗組大鼠腓腸肌萎縮程度較對照組輕；實驗組大鼠神經(jīng)斷端及傷側(cè)脊髓前角可見BrdU陽性染色的干細(xì)胞，且局部雪旺細(xì)胞增生活躍；○6電鏡下的超微結(jié)構(gòu)，CG組髓鞘形狀不規(guī)則，板層厚度較薄，部分可見脫髓鞘改變及軸突變性，雪旺細(xì)胞增生不