Hcy對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化修飾和mRNA表達(dá)的影響及葉酸的拮抗作用.pdf

1、研究背景與目的：同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)為非蛋白質(zhì)組成氨基酸，體內(nèi)不能合成，其生理作用主要是參與體內(nèi)一碳單位的代謝，目前公認(rèn)，體內(nèi)Hcy濃度升高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。本研究的主要目的是希望通過(guò)以臨床相關(guān)的高Hcy濃度處理人血管平滑肌細(xì)胞(human vascular smooth muscle cells，HVSMCs)，反作用于代謝Hcy的MTHFR基因，

2、檢測(cè)高Hcy對(duì)其啟動(dòng)子甲基化修飾及其mRNA表達(dá)的影響，以了解高Hey是否通過(guò)對(duì)MTHFR基因啟動(dòng)子的異常甲基化修飾產(chǎn)生正反饋的損傷效應(yīng)，即高Hcy→MTHFR基因啟動(dòng)子異常甲基化_MTHFR mRNA表達(dá)↓→MTHFR活性↓→Hcy進(jìn)一步↑，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行性發(fā)展。并同時(shí)探討葉酸可能的干預(yù)作用，為As的預(yù)防和治療提供新的思路和啟示。 材料和方法：本實(shí)驗(yàn)人血管平滑肌細(xì)胞取自正常臍動(dòng)脈，采用組織貼塊法獲得，加入含有20％胎

3、牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液于37℃的CO<,2>孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，選用3～7代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。分為對(duì)照組：正常生長(zhǎng)的平滑肌細(xì)胞；Hey處理組：不同濃度：Hcy(0,30，100，200，500,10001μmol/L)分別作用細(xì)胞24h，48h,72h；葉酸處理組：100μmol/L Hcy+FA(1001μmol/L)，500μmol/LHey+FA(100μmol/L)，F(xiàn)A(100μmol/L)，作用細(xì)胞72h。各組每24h更

4、換一次培養(yǎng)液，并添加新鮮配制的干預(yù)液。提取各組細(xì)胞基因組DNA，以巢式降落甲基特異性PCR(MS-PCR)分析MTHFR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)。提取各組細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定MTHFR mRNA的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)采用x±s表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：不同濃度和不同時(shí)間Hcy干預(yù)后，HVSMCs MTHFR基因啟動(dòng)子區(qū)域出

5、現(xiàn)去甲基化，甲基化水平明顯降低，RT-PCR結(jié)果顯示MTHFR mRNA表達(dá)增加，其mRNA表達(dá)水平在100μmol/LHcy時(shí)達(dá)到高峰，直至極高濃度Hcy時(shí)仍刺激MTHFR mRNA呈高表達(dá)，與對(duì)照組相比有顯著差異。此外，100μmol/L Hcy呈時(shí)間依賴關(guān)系促VSMCs MTHFR mRNA表達(dá)，72h達(dá)高峰；而葉酸能明顯抑制Hcy所引起的MTHFR基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化，RT-PCR結(jié)果顯示MTHFR mRNA表達(dá)亦有所降低，與

6、Hcy組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)顯著差異。 結(jié)論：綜合上述結(jié)果，本文顯示，高Hcy可通過(guò)引起DNA甲基化修飾的改變，而改變MTHFR基因的表達(dá)，葉酸可一定程度的拮抗這種效應(yīng)。Hcy誘導(dǎo)催化其自身向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶MTHFR基因DNA去甲基化和mRNA明顯高表達(dá)，顯然有助于降低過(guò)高的Hcy，這無(wú)疑是一種代償機(jī)制，而非高Hcy的損傷效應(yīng)；這提示環(huán)境因素對(duì)基因甲基化修飾的影響可以是損傷的、致病的，但亦可能是代償性反應(yīng)。由