可溶性纖維連接蛋白對(duì)SGC-7901細(xì)胞中PKA活性的影響及其機(jī)制的探究.pdf

1、研究目的:
　　 本研究通過(guò)向SGC-7901細(xì)胞中加入可溶性纖維連接蛋白(fibronectin,FN)以及蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)激活劑等探討可溶性纖維連接蛋白對(duì)PKA活性的影響并初步分析其機(jī)制,并進(jìn)一步研究可溶性FN對(duì)PKA相關(guān)的功能的影響。
　　 研究?jī)?nèi)容:
　　 (1)實(shí)驗(yàn)采用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中可溶性FN在不同濃度及作用時(shí)間情況下對(duì)PKA Cα亞基表達(dá)水

2、平以及PKA作用底物血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)磷酸化水平的影響；
　　 (2)檢測(cè)FN能否抑制由不同PKA激活劑活化的PKA,初步確定FN在cAMP／PKA信號(hào)通路中的作用位點(diǎn)；
　　 (3)采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)可溶性FN對(duì)PKA作用底物p-VASP分布的影響；
　　 (4)wtHt31質(zhì)粒和GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入SGC-7901細(xì)胞,建

3、立了能夠穩(wěn)定表達(dá)人甲狀腺A激酶錨定蛋白(human thyroid AKAP,Ht31)肽段的SGC細(xì)胞,探討破壞PKA錨定后FN對(duì)PKA活性的影響是否發(fā)生變化;
　　 (5)采用鬼筆環(huán)肽染色法檢測(cè)FN對(duì)正常SGC-7901細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染Ht31肽段的SGC細(xì)胞中的細(xì)胞骨架的影響；
　　 (6)利用細(xì)胞刮除-損傷實(shí)驗(yàn)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況,檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)條件下SGC-7901細(xì)胞遷移行為的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果:
　　 (1)在SGC-7901細(xì)胞中,選取1μg／ml可溶性FN作用12 h以后,可溶性FN對(duì)PKA活性存在時(shí)間依賴性抑制效應(yīng)；可溶性FN在0.5-8μg／ml濃度區(qū)間內(nèi)作用24 h以后,對(duì)PKA活性存在劑量依賴性抑制效應(yīng)；
　　 (2)可溶性FN可以抑制Forskolin引起的PKA活化,不能抑制外源性CPT-cAMP引起的PKA活化；
　　 (3)Ht31破壞PKA錨定后,FN對(duì)PKA活性的抑制作用消失

5、；
　　 (4)免疫熒光顯示可溶性FN可以使VASP磷酸化位置聚集于細(xì)胞邊緣；
　　 (5)Forskolin抑制可溶性FN在正常SGC-7901細(xì)胞邊緣處使應(yīng)激纖維聚集的作用,轉(zhuǎn)染wtHt31肽段的SGC細(xì)胞這種抑制作用被取消；
　　 (6)可溶性FN能夠拮抗PKA活化導(dǎo)致的細(xì)胞遷移抑制,這一作用受PKA錨定影響。
　　 結(jié)論:
　　 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為在SGC-7901細(xì)胞中可溶性FN