Imatinib抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型極化發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、目的:
　　近年來，大量的臨床與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，M2型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)在腫瘤的轉(zhuǎn)移，尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移至靶器官形成轉(zhuǎn)移灶的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。故而，有針對性的發(fā)展干預(yù)TAM M2型極化的化合物是極具應(yīng)用前景的抗腫瘤轉(zhuǎn)移新策略。但當(dāng)前臨床上干預(yù)巨噬細(xì)胞M2型極化的藥物仍是空白，因此從小分子化合物中篩選出有效抑制巨噬細(xì)胞M2型極化的化合物顯得尤為重要與迫切。
　　本文通過巨噬細(xì)胞M2型極化體外模型，篩選到了能有效抑

2、制巨噬細(xì)胞M2型極化的小分子化合物Imatinib，并進(jìn)一步評價(jià)了Imatinib對巨噬細(xì)胞極化的影響，研究其在腫瘤轉(zhuǎn)移至靶器官形成轉(zhuǎn)移灶的過程中的作用，以及Imatinib抑制巨噬細(xì)胞M2型極化的分子機(jī)制，我們的研究提出了Imatinib抗腫瘤轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，為Imatinib治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，豐富了小分子藥物通過干預(yù)巨噬細(xì)胞M2型極化發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的策略的可行性。
　　方法:
　　(1)采用SRB法，考察

3、Imatinib對巨噬細(xì)胞增殖的影響以及條件培養(yǎng)基對LLC細(xì)胞的影響。(2)采用流式細(xì)胞術(shù)手段，檢測M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志性蛋白CD206、M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志性蛋白CD86以及F4/80巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志性蛋白的影響;(3) RT-PCR方法檢測巨噬細(xì)胞M2型或M1型標(biāo)志基因的mRNA水平;(4)收集IL-13與Imatinib單獨(dú)或共同孵育巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，將其作用于LLC細(xì)胞，通過Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

4、考察其運(yùn)動(dòng)遷移能力，用同樣的方式考察IL-13與Imatinib單獨(dú)或共同作用對LLC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響;(5)建立LLC細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型，檢測Imatinib的體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用;(6)H&E染色法或肺表面轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)的方式考察腫瘤肺轉(zhuǎn)移的情況;(7)采用流式細(xì)胞術(shù)或組織免疫熒光或免疫組化方法檢測小鼠原發(fā)部位的腫瘤和轉(zhuǎn)移靶器官肺臟中的巨噬細(xì)胞M2型極化情況;(8)用western blot技術(shù)考察相關(guān)蛋白的變化情況;(9)采用細(xì)胞免疫熒光

5、方法檢測STAT6在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
　　結(jié)果:
　　(1) Imatinib能抑制巨噬細(xì)胞M2型極化而對M1極化無影響
　　我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-13或IL-4誘導(dǎo)的RAW264.7或BMDM，考察巨噬細(xì)胞M2型表面標(biāo)志性蛋白CD206的變化情況，發(fā)現(xiàn)IL-13能顯著增加CD206陽性細(xì)胞的比例，從1.51±0.97％至32.65±3.79％(p＜0.01)。而同時(shí)作用最高濃度的Imatinib能將其下調(diào)至9

6、.78±0.55％(p＜0.01)。而在IL-4誘導(dǎo)模型中也有相似的情況。采用Real-time PCR檢測M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性基因Arg1，Mgl2，Mrc1，CDH1以及CCL2的表達(dá)，結(jié)果顯示Imatinib能顯著抑制由IL-13或IL-4上調(diào)的M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄。以Arg1基因?yàn)槔?，IL-13可誘導(dǎo)Arg1的mRNA至對照組的71.7±13.1倍，而同時(shí)作用Imatinib可下調(diào)至4.6±2.2倍，具有顯著性差異

7、(p＜0.001)。
　　另一方面我們采用LPS和IFNγ共同刺激RAW264.7，構(gòu)建巨噬細(xì)胞M1型極化模型，通過流式細(xì)胞術(shù)考察巨噬細(xì)胞表面M1型標(biāo)志性蛋白水平，結(jié)果表明LPS和IFNγ能顯著上調(diào)CD86陽性細(xì)胞比例，從2.29±0.09％至43.56±4.4％(p＜0.01)，而同時(shí)作用Imatinib則對其無顯著影響(p＞0.05)。我們也通過Real-time PCR技術(shù)考察M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性基因iNOS、CCL5、T

8、NFα的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IFNγ和LPS能顯著上調(diào)iNOS、CCL5、TNFα分別至對照組的6.1±1.6、1.7±0.6、2.0±0.3，而同時(shí)作用Imatinib則無顯著變化(p＞0.05)。
　　(2) Imatinib通過干預(yù)巨噬細(xì)胞M2型極化發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用
　　在Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)IL-13誘導(dǎo)的條件培養(yǎng)基顯著增加LLC細(xì)胞遷移至小室下方，從每個(gè)視野118±14至211±27個(gè)(p＜0.

9、01);相比IL-13組條件培養(yǎng)基，Imatinib和IL-13共同孵育BMDM所得的條件培養(yǎng)基能顯著抑制LLC細(xì)胞的遷移至120±17個(gè)(p＜0.01)。而IL-13和Imatinib單獨(dú)或共同的直接作用對LLC細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力沒有明顯影響(p＞0.05)。
　　在小鼠LLC腋下接種模型和尾靜脈接種模型中，我們發(fā)現(xiàn)Imatinib能顯著減少小鼠肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，分別從平均1.3個(gè)減少至平均0.3個(gè)(p＜0.05)以及從11

10、.8±4.6個(gè)減少至6.0±4.3個(gè)(p＜0.05)。在LLC腋下接種模型中，我們考察了腫瘤原發(fā)部位的巨噬細(xì)胞極化情況，發(fā)現(xiàn)Imatinib組小鼠其中的M2-like TAM的比例(28.2±12.1％)顯著少于對照組(48.7±19.2％)(p＜0.01);在尾靜脈接種模型中，我們考察了實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第7天以及實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的靶器官肺臟中M2-like TAM的比例。實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)，免疫熒光結(jié)果表明Imatinib組小鼠肺臟中M2-l

11、ike TAM在巨噬細(xì)胞中的比例(25.7±4.5％)明顯少于對照組(64.5±2.3％)(p＜0.01)，流式細(xì)胞術(shù)方法考察也得到了相似的結(jié)果;而在實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)第24天），免疫組化結(jié)果顯示Imatinib明顯減少小鼠肺臟轉(zhuǎn)移灶處的M2-like TAM數(shù)量。以上結(jié)果表明，Imatinib可有效減少腫瘤細(xì)胞在肺臟的轉(zhuǎn)移灶處的M2-like巨噬細(xì)胞比例，抑制腫瘤細(xì)胞在肺臟中的進(jìn)一步增殖。
　　(3) Imatinib干預(yù)巨噬細(xì)胞

12、M2型極化的機(jī)制探究
　　我們通過western blot技術(shù)考察Imatinib對IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化過程中STAT6蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)Imatinib能顯著抑制STAT6的磷酸化。之后我們又通過免疫熒光考察巨噬細(xì)胞中STAT6蛋白的分布，發(fā)現(xiàn)Imatinib能顯著抑制IL-13誘導(dǎo)的STAT6入核的現(xiàn)象。說明Imatinib通過抑制STAT6的磷酸化以及入核作用發(fā)揮干預(yù)IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化。