脫細(xì)胞晶狀體前囊膜為載體培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過將增殖能力較強(qiáng)的青年期兔角膜緣干細(xì)胞(limbalstemcell,LSCs)[1]原代培養(yǎng)，擴(kuò)增后探索適宜的種植細(xì)胞密度。將其種植于同種異體晶狀體前囊膜上，探討晶狀體前囊膜為角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)載體潛在價(jià)值，為組織工程化角膜上皮載體選擇提供新的載體材料。
　　方法：（1）用酶消化法將增殖能力較強(qiáng)的青年兔角膜緣組織制備成細(xì)胞懸液培養(yǎng)，原代培養(yǎng)后將傳代細(xì)胞（2代），用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將其制備成1.0×1

2、06、1.0×105、1.0×104個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。將其接種于48孔培養(yǎng)板，觀察在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件一定的情況下傳代（2代）培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，48h檢測(cè)其細(xì)胞貼壁率并記錄細(xì)胞融合時(shí)間；CCK-8法檢測(cè)增殖活性。（2）以適宜細(xì)胞密度將其種植于同種異體兔晶狀體前囊膜上，對(duì)照組無為無載體培養(yǎng)，DMEM:F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，觀察在其上的生長(zhǎng)情況，免疫熒光法檢測(cè)角膜緣細(xì)胞的△Np63、角蛋白K3表達(dá)，運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所獲

3、數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：（1）在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件一定的情況下，以1.0×104個(gè)細(xì)胞/ml接種48h換液，懸浮細(xì)胞較多，可見少數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞貼壁率低和融合成單層時(shí)間長(zhǎng)，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。以1.0×106和1.0×105個(gè)細(xì)胞/ml接種，48h貼壁細(xì)胞明顯增多。貼壁率分別為86.84±7.04和74.52±6.16；細(xì)胞融合成單層時(shí)間分別是6.02±0.52和7.06±0.46;兩組間比較差異

4、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CCK-8法生長(zhǎng)曲線顯示，以1.0×105個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞密度接種，細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖活性，細(xì)胞密度過高過低在有限的培養(yǎng)條件下都會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。（2）同種異體晶狀體前囊膜為載體，角膜緣干細(xì)胞可貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈圓形、橢圓形和多邊形，細(xì)胞間連接緊密。約7天左右可形成細(xì)胞植片。免疫熒光染色△Np63大部分細(xì)胞呈陽性，角蛋白K3少量細(xì)胞表達(dá)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)△Np63表達(dá)量下降，角蛋白K3表達(dá)量上升，與對(duì)