基于銅綠假單胞菌群體感應(yīng)苯磺酸氨氯地平增加抗菌效應(yīng)的機制研究.pdf

1、目的：
　　群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensingsystem，QSS）為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）毒力因子表達的重要調(diào)控系統(tǒng)。PA群體感應(yīng)（quorum sensing， QS）的引發(fā)與胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度（cytosolic free Ca2+ concentration，[Ca2+]i）的升高有關(guān)。鈣拮抗劑苯磺酸氨氯地平（amlodipine besylate，AML）可拮抗胞外

2、的Ca2+內(nèi)流，調(diào)控PA的[Ca2+]i，從而抑制PA的QS。本研究探討AML的QS抑制活性及其可能機制。
　　方法：
　　1.細菌培養(yǎng)
　　采用平板劃線法活化并分離單一菌落，制備斜面工作管。挑取單一菌落分別于LB、MH、PTSB液體培養(yǎng)基搖床有氧培養(yǎng)。
　　2.分組與給藥
　　設(shè)立正常對照組、0.5％二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶劑對照組、鈣離子載體A23187組（1μg·m

3、L-1）及AML組（64、32、16μg·mL-1）。
　　3.測定指標及方法
　　3.1平板菌落計數(shù)法測定PA菌液中的活菌數(shù)，并繪制PA對數(shù)期“活菌數(shù)-OD600”標準曲線，光電比濁法測定PA菌液中的活菌數(shù)（λ=600 nm）
　　3.2光電比濁法測定AML對PA增殖的影響并繪制生長曲線（λ=600 nm）
　　3.3微量肉湯稀釋法測定藥物對 PA的最低抑菌濃度(minimun inhibitory conce

4、ntration，MIC）
　　3.4蛋白水解酶試驗測定PA蛋白水解酶的表達
　　3.5彈性蛋白酶試驗測定PA彈性蛋白酶的表達
　　3.6綠膿毒素試驗測定PA綠膿毒素的表達
　　3.7以Fura-2/AM為Ca2+熒光探針，熒光顯微鏡下觀察探針在PA的負載情況，并用雙波長熒光分光光度法測定PA的[Ca2+]i
　　結(jié)果：
　　1.PA對數(shù)期菌液的“活菌數(shù)-OD600”標準曲線為y=0.0797x+0.

5、0094，R2=0.9975
　　2.AML對PA的MIC為512μg·mL-1
　　3.AML（256、128μg·mL-1）可抑制PA的生長（P<0.05）；AML（64、32、16μg·mL-1）對PA的生長無影響，選定AML（64、32、16μg·mL-1）作為實驗濃度
　　4.AML（64、32、16μg·mL-1）可明顯抑制PA綠膿毒素的表達（P<0.01）；可抑制蛋白水解酶和彈性蛋白酶的表達（P<0.05

6、）
　　5.Fura-2/AM可成功負載于PA胞內(nèi)，可用340 nm/380 nm熒光強度比值R（F340nm/F380nm）測定PA[Ca2+]i
　　6.AML（64、32、16μg·mL-1）可降低PA[Ca2+]i（P<0.05）
　　結(jié)論：
　　1.AML（64、32、16μg·mL-1）可抑制PA毒力因子的表達
　　2.AML抑制PA毒力表達的作用可能與干擾PA的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控PA的QS系統(tǒng)