熒光原位雜交檢測(cè)尿脫落細(xì)胞染色體異常診斷膀胱腫瘤的研究

1、<p>　　熒光原位雜交檢測(cè)尿脫落細(xì)胞染色體異常診斷膀胱腫瘤的研究</p><p>　　王 鵬，靳風(fēng)爍，葉 錦，吳 剛，李彥鋒，張 堯，梁 平 （第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042）</p><p>　　摘 要：目的 本研究旨在探討通過(guò)熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)

2、3、7、9、17號(hào)染色體數(shù)目畸變?cè)\斷國(guó)人膀胱尿路上皮癌的可行性和有效性。方法 采用3、7、17 號(hào)染色體著絲粒探針和9p21區(qū)帶探針對(duì)140例觀(guān)察者尿液脫落細(xì)胞核行熒光原位雜交，并同時(shí)行經(jīng)腹部超聲和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，以膀胱鏡病理檢查確診，比較分析各種方法的敏感性和特異性。結(jié)果 ⑴ 腫瘤組80例膀胱尿路上皮癌全部經(jīng)病理檢查確診，其中68例FISH結(jié)果陽(yáng)性，26例尿脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性，71例經(jīng)腹部超聲診斷為膀胱癌。⑵ 非腫瘤對(duì)照組30例，其

3、中29例FISH結(jié)果陰性，1例假陽(yáng)性；尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查全部陰性；經(jīng)腹超聲檢查23例陰性，7例假陽(yáng)性。FISH、尿脫落細(xì)胞學(xué)、經(jīng)腹部超聲的靈敏度分別為85.00%、32.50%、88.75%，特異度分別為96.67%、100.00%、76.67%。結(jié)論 使用FISH技術(shù)檢測(cè)尿脫落細(xì)胞3、7、9、17號(hào)染色體數(shù)目畸變，具有敏感度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，并具無(wú)創(chuàng)性，對(duì)國(guó)人膀胱尿路上皮癌的診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。</p><

4、;p>　　關(guān)鍵詞：膀胱腫瘤；原位雜交；診斷</p><p>　　中圖法分類(lèi)號(hào)：R737.14 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A</p><p>　　The study on urine exfoliated cell chromosome aberration detected by fluorescence in situ

5、 hybridization of the bladder </p><p>　　Wang Peng, Jin Feng-shuo Ye Jin, Wu Gang, Li Yan-feng, Zhang Yao, Liang Ping (Department of Urology, The Third Affiliated Hospital of Third Military Medicial Universit

6、y, Chongqing 400042, China)</p><p>　　Abstract：Objective The aim of this study was to evaluate the possibility and validity of detecting numerical aberration of chromosome 3,7,9,17 by fluorescence in situ hyb

7、ridization (FISH) in detecting urothelial carcinoma of bladder in Chinese. Mehtods 140 volunteers were recruited as subjects. Exfoliated cells from fresh urinary specimen was collected and the cell was examined by FISH u

8、sing centromeric probes of chromosome 3,7,17 and region probe of 9p21. Cytology and transabdominal ultrasonogr</p><p>　　Key words：Bladder neoplasm; In situ hybridization; Diagnosis</p><p>　　膀胱癌是

9、我國(guó)泌尿男性生殖系最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其中尿路上皮癌占90%以上。目前，經(jīng)腹部泌尿</p><p>　　基金項(xiàng)目：衛(wèi)生部科研基金（WKJ2007-3-001）</p><p>　　Supported by the Research Funds of the ministry of health（WKJ2007-3-001）</p><p>　　作者簡(jiǎn)介：王 鵬，男，

10、河南省駐馬店市人，碩士研究生，醫(yī)師，主要從事膀胱腫瘤疾病方面的研究。電話(huà)：13658336305，E-mail：Wodeyouxiang2006131@126.com</p><p>　　通信作者：靳風(fēng)爍，電話(huà)：（023）68757946，E-mail：jinfs5505@163.com</p><p>　　收稿日期：2009-02-12；修回日期：2009-03-16</p>

11、<p>　　系超聲檢查、膀胱鏡檢查、尿脫落細(xì)胞學(xué)及尿液</p><p>　　腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)是用于發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)膀胱癌普遍使用的4種手段。然而，尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)敏感性太低，膀胱鏡則為有創(chuàng)檢查，患者痛苦，難以接受，對(duì)于肉眼見(jiàn)不到的腫瘤診斷也存在困難。經(jīng)腹超聲檢查較尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查診斷敏感性高，但特異性差，且易受膀胱內(nèi)血凝塊、腫瘤大小及位置的影響而導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性的診斷結(jié)果。尿液腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)多用于膀胱腫

12、瘤的篩查，易受血尿、尿路感染、膀胱灌注治療的影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，不能成為可靠的診斷指標(biāo)。因此,人們一直在探索更為有效、簡(jiǎn)便、安全的診斷尿路上皮癌的方法。</p><p>　　近年來(lái)，隨著對(duì)膀胱癌遺傳學(xué)改變的深入研究，發(fā)現(xiàn)9號(hào)染色體部分（如p16位點(diǎn)）或全部丟失是最常見(jiàn)遺傳學(xué)改變，且膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與3號(hào)、7號(hào)及17號(hào)染色體的非整倍性密切相關(guān)。初步臨床研究顯示，對(duì)尿液中脫落細(xì)胞進(jìn)行以上遺傳學(xué)改變的檢測(cè)對(duì)膀胱尿路

13、上皮癌的診斷及預(yù)后評(píng)估具有很大意義[1,2]。我國(guó)學(xué)者有關(guān)膀胱癌遺傳學(xué)研究表明,中國(guó)人與西方人膀胱癌的遺傳學(xué)背景存在一定的差異[3],用FISH 技術(shù)檢測(cè)3、7、9、17號(hào)染色體異常對(duì)中國(guó)人膀胱尿路上皮癌的診斷價(jià)值仍不明了。</p><p>　　本研究采用FISH技術(shù)檢測(cè)140例觀(guān)察者尿脫落細(xì)胞核3、7、9、17號(hào)染色體，并與經(jīng)腹部超聲、膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)膀胱腫瘤的方法比較，以探討FISH技術(shù)在膀胱癌診

14、斷中的應(yīng)用價(jià)值。</p><p><b>　　1 資料與方法</b></p><p>　　1.1 受檢者資料及分組</p><p>　　1.1.1 腫瘤組 80例膀胱尿路上皮癌血尿患者，其中男性58例，女性22例，年齡26～83歲。根據(jù)膀胱腫瘤2002 TNM分期系統(tǒng)和 WHO 2004分級(jí)法，腫瘤的臨床病理情況：Ta 17例，T1

15、 29例，T2 21例，T3 8例，T4 5例；G1 35例，G2 25例，G3 20例。</p><p>　　1.1.2 正常對(duì)照組 30例正常人。其中男性15例，女性15例，年齡20～60歲。</p><p>　　1.1.3 非腫瘤對(duì)照組 30例同期治療的血尿患者，包括：腺性膀胱炎患者10例，良性前列腺增生患者10例，慢性膀胱炎患者10例。其中男性19例，女性11例，年

16、齡29～81歲。</p><p><b>　　1.2 診斷方法</b></p><p>　　所有受檢者均行經(jīng)腹部泌尿系超聲檢查、尿脫落細(xì)胞學(xué)和FISH檢測(cè)，腫瘤組及非腫瘤對(duì)照組以膀胱鏡病理檢查確診。每例患者于膀胱鏡檢查前或手術(shù)前連續(xù)3d收集新鮮尿液，每次300ml左右，將每例尿樣分為2份，分別行尿液脫落細(xì)胞學(xué)常規(guī)檢查和尿液脫落細(xì)胞FISH檢測(cè)。腫瘤組及非腫瘤對(duì)照組經(jīng)

17、膀胱鏡活檢或手術(shù)治療取得組織標(biāo)本，并送病理科常規(guī)石蠟切片，由同一病理科醫(yī)師判讀切片結(jié)果。</p><p><b>　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　FISH技術(shù)使用的3、7、17 號(hào)染色體著絲粒探針和9p21區(qū)帶探針購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。3號(hào)、17號(hào)染色體著絲粒探針為綠色熒光信號(hào)，7號(hào)染色體著絲粒探針和雜交到9號(hào)染色體長(zhǎng)臂（9p21）的P1

18、6探針為桔紅色熒光信號(hào)。收集受檢者新鮮尿液后分為2份，1份按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)操作，另1份離心涂片，HE染色尋找腫瘤細(xì)胞[4]。</p><p>　　1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果分析</p><p>　　熒光顯微鏡下觀(guān)察，通過(guò)FISH點(diǎn)計(jì)數(shù)分析2.0軟件控制的CCD攝取圖像，每組探針?lè)治?00～200個(gè)細(xì)胞。結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)：判定單體的標(biāo)準(zhǔn)為單個(gè)信號(hào)的核比例＞15%；3倍體及多倍

19、體的標(biāo)準(zhǔn)為3個(gè)及多個(gè)信號(hào)的核＞10%細(xì)胞總數(shù)。組合探針陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)參照UroVysion推薦標(biāo)準(zhǔn)[5]：至少在4個(gè)細(xì)胞中同時(shí)存在3、7、17中的2個(gè)染色體的擴(kuò)增，或至少在12個(gè)細(xì)胞中存在9p21純合性缺失。尿脫落細(xì)胞學(xué)以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞為陽(yáng)性，其余為陰性。根據(jù)診斷實(shí)驗(yàn)配對(duì)四格表和計(jì)算公式[6]，靈敏度＝真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性＋假陰性），特異度＝真陰性/（假陽(yáng)性＋真陰性）。</p><p>　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析</

20、p><p>　　所有資料均使用SPSS 13.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　在正常人和非尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結(jié)果顯示各探針表現(xiàn)為2紅、2綠2個(gè)雜交信號(hào)（圖1）。在尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結(jié)果可見(jiàn)不同程度的染色體數(shù)目異常（圖2）。30例正常人FISH及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

21、病例組、對(duì)照組各項(xiàng)診斷結(jié)果見(jiàn)表1（圖3、圖4）。本研究中FISH診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度與經(jīng)腹部超聲檢查相似（χ2=0.493，P =0.482），低于膀胱鏡檢查（χ2=12.973，P =0.000），顯著優(yōu)于尿脫落細(xì)胞學(xué)（χ2=45.493，P =0.000）；特異性接近尿脫落細(xì)胞學(xué)（χ2=1.017，P =0.313）和膀胱鏡檢查（χ2=1.017，P =0.313），優(yōu)于經(jīng)腹部超聲檢查（χ2＝5.192，P =0.023）（表

22、2）。使用FISH技術(shù)診斷膀胱尿路上皮癌，Ta、T1、T2、T3、T4 的靈敏度分別為：64.70%（11/17）、86.21%（25/29）、95.24%（20/21）、87.50%（7/8）、100.00%（5/5），Ta 與T1 -T4相比敏感性較低。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)Ta腫瘤的靈敏度為11.76%（2/17），與FSIH相比有較顯著的差異（</p><p><b>　　3 討論</b>

23、;</p><p>　　FISH技術(shù)是分子細(xì)胞遺傳學(xué)最常使用的研究手段之一，其主要用于染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變的研究。FISH技術(shù)的發(fā)展使得細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)緊密</p><p>　　地結(jié)合在一起，既可顯示中期染色體，也可以顯示間期核中的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)上的異常，而染色體分析已被認(rèn)為是許多惡性腫瘤的診斷和預(yù)后指標(biāo)之一。在本研究當(dāng)中，F(xiàn)ISH技術(shù)采用熒光標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)3、7、17、9p2

24、1號(hào)染色體，以確定有無(wú)與膀胱癌相關(guān)的非整倍體來(lái)診斷膀胱尿路上皮癌。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道膀胱尿路上皮癌患者9p21的純合性缺失率高達(dá)83.00%[7]，研究表明9p21含有重要的抑癌基因p16，與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，不論是純合性缺失還是單體，都意味著遺傳物質(zhì)的缺失，這可能對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，所以有人認(rèn)為9p21缺失是尿路上皮癌早期最常見(jiàn)的改變之一，其有可能作為早期診斷和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的重要分子標(biāo)志。Veeramachaneni等[8]報(bào)道3號(hào)染

25、色體多倍體高達(dá)76.00%，定位于3p25的RAFI基因過(guò)表達(dá)與膀胱尿路上皮癌的病理分級(jí)相關(guān)[9]。7號(hào)染色體多倍體發(fā)生率大約為76.20% [7]，Sauter等[10]認(rèn)為7號(hào)染色體多倍體與病理分期、分級(jí)顯著相關(guān)，7號(hào)染色體畸變可能在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Gallicci等[11]研究表明，17號(hào)染色體畸變率為74.00%，17號(hào)</p><p>　　目前，膀胱鏡活檢組織病理檢查為診斷膀胱癌的

26、金標(biāo)準(zhǔn)，尿脫落細(xì)胞學(xué)、經(jīng)腹部超聲檢查、尿核基質(zhì)蛋白22( NMP22)、膀胱腫瘤抗原(BTA)及ImmunoCyt 等腫瘤標(biāo)記物是發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)膀胱癌的常用方法。但膀胱鏡為有創(chuàng)檢查，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致出血、膀胱穿孔等并發(fā)癥，患者常不愿接受，對(duì)于處于泌尿系統(tǒng)急性感染期、尿道狹窄、膀胱容量過(guò)小、出血性疾病、女性月經(jīng)期及不能接受膀胱截石體位的患者無(wú)法行膀胱鏡檢查。膀胱鏡的視野也有一定的盲區(qū)，如膀胱頸部，尤其是近12點(diǎn)處，因而用于篩查膀胱癌患者受到很大限

27、制。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方便、簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、特異性高，但靈敏度太低，文獻(xiàn)報(bào)道陽(yáng)性率為20%～30%。在本研究中，盡管我們對(duì)細(xì)胞學(xué)檢查給予了足夠的重視，其陽(yáng)性率也只有32.50%，這些結(jié)果都提示僅依賴(lài)細(xì)胞學(xué)檢查會(huì)造成大量患者漏診。另外，尿標(biāo)本中細(xì)胞不典型或退行性變、泌尿系感染、結(jié)石以及膀胱灌注治療等也可導(dǎo)致尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷困難。經(jīng)腹部泌尿系超聲檢查經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、靈敏度較高，可重復(fù)性強(qiáng)，已成為膀胱癌的常規(guī)檢查方法，但其特異性較低，且對(duì)于非隆起

28、性病灶及直徑小于0.5cm的腫瘤，超聲難以發(fā)現(xiàn)，位于膀胱頂部及前壁的腫瘤因易受</p><p>　　從本研究中可以看出，隨著腫瘤級(jí)別的增高，F(xiàn)ISH 的靈敏度也隨之升高，F(xiàn)ISH對(duì)G3的靈敏度高于G1（χ2=4.420，P =0.036），對(duì)G2的靈敏度也高于G1（χ2=5.881，P =0.015），但G3與G2比較無(wú)顯著性差異（χ2=0.026，P =0.872），可能是由于隨著腫瘤級(jí)別升高，腫瘤細(xì)胞內(nèi)染色體

29、畸變率增高，腫瘤細(xì)胞容易脫落的緣故。張業(yè)貴等[5]采用FISH技術(shù)對(duì)57例膀胱尿路上皮癌進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤級(jí)別升高，陽(yáng)性率增高，因使用標(biāo)本為手術(shù)中切除的新鮮膀胱尿路上皮癌組織的細(xì)胞，所以只能用于術(shù)后研究，不能用于術(shù)前診斷。Ta 與T1-T4相比敏感性較低，流式細(xì)胞儀分析Ta期膀胱腫瘤90%為2倍體，比較基因組研究顯示高分化Ta較少有基因變異，這些可以解釋FISH技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)部分Ta期膀胱尿路上皮癌患者。此外尿量不夠、低腫瘤負(fù)荷、腫

30、瘤細(xì)胞脫落較少也可能對(duì)敏感性有影響。</p><p>　　本研究證實(shí)，使用尿脫落細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)3、7、9、17號(hào)染色體數(shù)目畸變?cè)\斷國(guó)人膀胱尿路上皮癌，具有敏感度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，并具無(wú)創(chuàng)性，尤其對(duì)早期尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，對(duì)膀胱癌的診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>

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