應(yīng)用國產(chǎn)熒光原位雜交探針快速檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目.pdf

1、目的：研究熒光原位雜交(FISH)技術(shù)在快速產(chǎn)前診斷胎兒染色體數(shù)目中的應(yīng)用；探討該技術(shù)在產(chǎn)前遺傳學(xué)疾病尤其是唐氏綜合征(DS)診斷中的效果及推廣價(jià)值，并摸索國產(chǎn)FISH探針的實(shí)驗(yàn)性能及在產(chǎn)前快速診斷中的應(yīng)用前景。
　　 方法：(1)建立FISH檢測(cè)試驗(yàn)組及常規(guī)染色體檢查對(duì)照組：在B超引導(dǎo)下羊膜腔穿刺抽取血清篩查DS高危孕婦17-23孕周的羊水標(biāo)本，將每份標(biāo)本中提取的胎兒脫落細(xì)胞不經(jīng)培養(yǎng)分為FISH試驗(yàn)組及常規(guī)染色體核型分析組進(jìn)入

2、下一實(shí)驗(yàn)步驟。FISH組胎兒脫落細(xì)胞經(jīng)過預(yù)處理、樣本變性、探針變性、雜交及其后處理、熒光顯微鏡觀察等程序；染色體核型分析組中胎兒脫落細(xì)胞進(jìn)入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、篩選及染色體核型分析步驟。(2)探討FISH技術(shù)在DS快速產(chǎn)前診斷中的價(jià)值：通過比較兩組的試驗(yàn)結(jié)果、吻合度及差異性，分析在適宜羊水脫落細(xì)胞檢查的短暫窗口期內(nèi)，F(xiàn)ISH技術(shù)在染色體數(shù)目檢測(cè)中的快速性、安全性與其準(zhǔn)確性、特異性與常規(guī)染色體核型分析的優(yōu)缺點(diǎn)。(3)摸索國產(chǎn)FISH探針的適用條

3、件，總結(jié)其優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用前景：應(yīng)用衛(wèi)生部課題組提供的國產(chǎn)探針，研究其在特異性染色體數(shù)目檢測(cè)中的試驗(yàn)條件、結(jié)果準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性等。
　　 結(jié)果：①在80例合格羊水標(biāo)本中，試驗(yàn)組中76例雜交良好，鏡下觀察見背景暗，熒光信號(hào)明亮清晰。4例雜交失敗，其中1例在鏡下背景亮，難以找到清晰熒光點(diǎn)；另3例鏡下觀察背景暗但胞核內(nèi)存在大量散在熒光信號(hào)。常規(guī)組80例中79例細(xì)胞培養(yǎng)成功，核型分析完整清晰。79例染色體結(jié)果中78例染色體數(shù)目正常，1例發(fā)現(xiàn)2

4、1三體。②試驗(yàn)組中雜交良好的76例結(jié)果與常規(guī)組中相應(yīng)結(jié)果一致，且所有結(jié)果均與產(chǎn)后隨訪信息吻合。試驗(yàn)組平均每例標(biāo)本耗時(shí)2d，成功率為95％；常規(guī)組每例標(biāo)本耗時(shí)18d，成功率為98.7％。由于常規(guī)染色體核型分析屬于技術(shù)成熟穩(wěn)定的檢測(cè)方法，從與該法的比較中提示FISH技術(shù)的成功率雖低于染色體核型分析，但其能夠在很短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的染色體數(shù)目，從而達(dá)到產(chǎn)前快速診斷的目的。特別是對(duì)于只有孕中期特定階段適合羊水分析的孕婦來說，檢查時(shí)間上的節(jié)

5、省能夠?yàn)樗齻儬?zhēng)取更多尋求干預(yù)及進(jìn)一步處理的寶貴機(jī)會(huì)。③與進(jìn)口同類產(chǎn)品相比較，國產(chǎn)FISH探針因價(jià)格較低且檢測(cè)結(jié)果較理想而具備臨床推廣價(jià)值。但仍存在改進(jìn)之處，例如對(duì)試驗(yàn)條件要求高、熒光信號(hào)強(qiáng)弱不穩(wěn)定及試驗(yàn)結(jié)果衰退過快等。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)的摸索中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞初期的雜質(zhì)處理至關(guān)重要，需要加大膠原酶B的用量或延長(zhǎng)時(shí)間；國產(chǎn)探針穿透核膜的能力受到核膜的前期處理影響較大，因此需要將胃蛋白酶的用量及作用時(shí)間穩(wěn)定在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)；對(duì)于探針變性溫度和復(fù)性時(shí)間，我們

6、也分別提升到77-78℃及延長(zhǎng)到28min，結(jié)果滿意。并且這種情況下熒光淬滅速度減慢，如在雜交后標(biāo)本受到良好保存的前提下，試驗(yàn)后1天內(nèi)仍可觀察到陽性結(jié)果。
　　 結(jié)論：⑴利用未經(jīng)培養(yǎng)的中期妊娠羊水進(jìn)行熒光原位雜交定位，可以快速準(zhǔn)確地診斷胎兒的染色體數(shù)目，有推廣應(yīng)用于臨床的前景。⑵處理胎兒脫落細(xì)胞技術(shù)對(duì)于熒光原位雜交成敗具有關(guān)鍵影響，也是延長(zhǎng)適宜檢測(cè)孕周跨度的重要指標(biāo)。⑶仍需要在控制實(shí)驗(yàn)室條件，不斷提高國產(chǎn)熒光原位雜交探針檢測(cè)胎兒