豬USF1和MBF1基因的克隆、鑒定及多態(tài)性分析.pdf

1、以功能基因組學(xué)、分子標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等分子育種技術(shù)逐步與傳統(tǒng)的育種方法緊密結(jié)合并作為生物科技的前沿領(lǐng)域，已成為當(dāng)代豬育種的重要方向，加速了豬的遺傳改良進(jìn)程。大量生物信息學(xué)的發(fā)展和公共數(shù)據(jù)資源庫的共享，為分離、定位和篩選具有影響豬性狀的基因提供了新的思路。本論文通過候選基因的方法，并結(jié)合豬的EST信息和比較基因組的策略，分離鑒定豬兩個(gè)與脂肪沉積相關(guān)的新基因，并對(duì)基因與部分性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析和結(jié)構(gòu)功能域的預(yù)測，取得了如下結(jié)果：

2、 1.依據(jù)候選基因法，從GenBank中搜索豬的同源EST，由EST構(gòu)成的連接群(contig)設(shè)計(jì)引物，從大白、梅山豬cDNA中分離克隆兩個(gè)基因upstream transcriptionfactor 1(USF1)，Multiprotein bridging factor 1(MBF1)和USF1基因的一個(gè)新轉(zhuǎn)錄本USF1/CD，將USF1/和USF1/CD序列提交到GenBank收錄號(hào)分別為EF 219407和EF 208923

3、。 2.根據(jù)已獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，分別以大白和梅山豬DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增、克隆并測序拼接后獲得USF1基因所有的第1外顯子到第11外顯子序列，長度為5516bp，序列提交到GenBank收錄號(hào)為EF 625884。經(jīng)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了第10內(nèi)含子上有1個(gè)T-C突變，導(dǎo)致AluI酶切多態(tài)性。獲得了MBF1基因的第2外顯子到第5外顯子序列提交到GenBank收錄號(hào)為EF 625885，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)共有7個(gè)SNPs其中兩個(gè)位于

4、第4外顯子，4個(gè)位于第4內(nèi)含子，第4外顯子的C42T突變引起Fsp4HI酶切多態(tài)性，C81T突變引起TaqI酶切多態(tài)性。 3.采用半定量RT-PCR方法檢測了USFI兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本和MBF1基因在豬心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、脂肪、肌肉、卵巢、子宮等11個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明USF1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本和MBFl基因在所檢測的組織中廣泛表達(dá)。 4.對(duì)USF1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本和MBF1基因的氨基酸序列進(jìn)行了功能結(jié)構(gòu)域、親水性和疏水性的

5、預(yù)測，利用網(wǎng)上CLUSTAL W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用DNASar軟件的CLUSTALW方法進(jìn)行相關(guān)的進(jìn)化樹分析。 5.采用PCR.RFLP方法檢測了USFI基因第10內(nèi)含子和MBF1基因第4外顯子區(qū)的多態(tài)性在不同豬種中的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：USFI基因在外來豬種中等位基因A占多數(shù)，大白、長白豬A等位基因的頻率分別為1.00和0.85；而在中國豬種中B等位基因的頻率占優(yōu)勢，在梅山和通城豬中B等位基因的頻率分別為0.79和0.83。

6、MBF1基因在國外豬種中等位基因A的頻率占優(yōu)勢，大白、長白豬A等位基因的頻率分別為0.81和0.86；而在中國豬種中B等位基因的頻率占優(yōu)勢，在梅山和通城豬中B等位基因的頻率分別為0.94.和0.71。 USE1基因第10內(nèi)含子PCR-AluⅠ-RFLP在421頭大梅F2代資源家系進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析表明：USF1基因?qū)κ莘嗜獗壤?、屠宰率、平均背膘厚、眼肌寬、眼肌面積、背最長肌含水量的效應(yīng)達(dá)到顯著水平，對(duì)瘦肉率、眼肌高的效應(yīng)達(dá)到極顯著

7、；屠宰率、平均背膘厚、眼肌面積加性效應(yīng)顯著(p<0.05)；眼肌寬、眼肌高加性效應(yīng)極顯著(p<0.01)。瘦肉率、瘦肥肉比例、眼肌高、眼肌面積顯性效應(yīng)顯著(p<0.05)。 MBF1基因第4外顯子PCR-Taq Ⅰ-RFLP在447頭大梅F2代資源家系進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析表明：MBF1基因?qū)锹?、瘦肉率、板油重、肩部最厚處背膘厚?-7腰椎間背膘厚、眼肌高、眼肌寬、眼肌面積、背最長肌含水量的效應(yīng)達(dá)到顯著水平。骨率、6-7腰椎間背膘厚、眼肌高