高爾基體蛋白ACBD3參與腸道病毒復制的機制研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)是引起嬰幼兒重癥手足口病的主要病原體，其感染可導致嚴重的神經(jīng)性疾病，包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎和神經(jīng)性肺水腫等。近年來大規(guī)模發(fā)生的手足口病疫情，嚴重危害嬰幼兒、尤其是農(nóng)村地區(qū)幼兒的身體健康，給公共衛(wèi)生的發(fā)展帶來巨大挑戰(zhàn)。
　　EV71屬于小RNA科病毒，報道表明小RNA病毒科病毒利用宿主細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)進行自身基因組的復制。病毒感染導致細胞內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)生改變，富集病毒復制所需因子，形成不同于細胞內(nèi)膜的膜結(jié)構(gòu)，

2、包含不同的蛋白組分和脂質(zhì)組分，即病毒復制中心。病毒利用復制中心的宿主因子和病毒自身蛋白完成復制。最初報道表明高爾基體蛋白GBF1和ARF1在病毒復制中發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，ACBD3介導嵴病毒3A蛋白募集病毒復制重要蛋白PI4KB至病毒復制中心。多種腸道病毒的3A蛋白也可以與ACBD3相互作用，但這種相互作用在不同病毒復制中的作用和機制不同，如柯薩奇病毒和鼻病毒的3A可以與ACBD3結(jié)合，但ACBD3并不參與二者的復制。目前，有關(guān)A

3、CBD3在腸道病毒復制中的作用仍存在爭議。前期通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)EV71的3A蛋白能與ACBD3相互作用。因此，本課題圍繞ACBD3在EV71病毒復制中的作用和分子機制進行深入的研究，以期進一步闡明EV71的復制機制，發(fā)現(xiàn)潛在的抗病毒藥物靶標，為病毒致病機理和抗病毒藥物的設計研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　通過外源性共轉(zhuǎn)染3A和ACBD3蛋白，驗證了ACBD3和3A的相互作用。進一步發(fā)現(xiàn)病毒感染后，EV713A也可以與內(nèi)源性ACBD3共定

4、位，并影響ACBD3在細胞內(nèi)的分布。利用RNAi敲低ACBD3的表達，或是利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除ACBD3的表達后EV71病毒基因組的復制、蛋白的翻譯及空斑形成能力均受到了抑制。而當回復ACBD3的表達后，病毒基因組的復制、蛋白的翻譯及空斑形成能力又可以得到拯救。通過突變和免疫共沉淀定位了ACBD3與3A相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，發(fā)現(xiàn)ACBD3的C端在其與3A結(jié)合中起著關(guān)鍵作用，而3A的41-86AA在其與ACBD3結(jié)合中十分重要

5、。同時通過點突變發(fā)現(xiàn)EV713A的第44位異亮氨酸和第54位的組氨酸是二者相互作用中的關(guān)鍵位點。以上結(jié)果說明，ACBD3通過與EV71的3A蛋白結(jié)合參與病毒復制。
　　此外，參與EV71復制的另外一個重要分子是PI4KB，但在EV71復制中如何募集至復制中心還不是十分清楚。首先驗證了PI4KB是否參與EV71復制，發(fā)現(xiàn)PI4KB的抑制劑能抑制EV71病毒的復制，同時，利用RNAi技術(shù)敲低PI4KB的表達或是利用CRISPR/Cas

6、9技術(shù)敲除PI4KB的表達后EV71病毒基因組的復制、蛋白的翻譯及空斑形成能力均受到了抑制。進一步研究PI4KB募集至復制中心的機制，發(fā)現(xiàn)EV713A能夠增強PI4KB與ACBD3間的相互作用，并且感染后三者均定位于病毒的復制中心，同時，EV71病毒感染細胞后能導致復制中心附近PI4P的量的增加，而這些過程均需要ACBD3的參與。分子篩層析實驗發(fā)現(xiàn)，在EV71病毒感染細胞后，會形成一個含有ACBD3，PI4KB，EV71-3A及EV71

7、-3D的大分子復合物。EV71-3A第44位及第54位氨基酸的突變同樣會抑制ACBD3與PI4KB的結(jié)合。最后，發(fā)現(xiàn)ACBD3同樣參與到EV68病毒的復制過程中，而對HRV16病毒的復制不起作用。上述實驗結(jié)果說明，PI4KB參與EV71病毒的復制，并通過形成3A-ACBD3-PI4KB分子復合物的形式促進EV71及EV68病毒的復制，而HRV16的復制機制還需后續(xù)深入研究。該研究結(jié)果闡述ACBD3在腸道病毒復制過程中的作用機制。