胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌ApxIVA基因的克隆、表達(dá)及其與豬多殺性巴氏桿菌的雙重PCR診斷.pdf_第1頁(yè)
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1、1.豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌ApxIVA毒力基因的克隆和表達(dá)。參照GenBank中的豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae.APP)溶血素(Apx)IVA基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增到992bp的目的片段，將其插入pMD-18T載體中，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21中，轉(zhuǎn)化菌入含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h，挑選白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，將鑒定

2、正確的質(zhì)粒測(cè)序。用EcoRⅠ和HindⅢ從克隆載體中切下目的片段，凍溶法回收酶切片段，在T4DNA連接酶的作用下重組入經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的表達(dá)載體pET-28a中，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)，挑取白色菌落培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，目的基因獲得高效表達(dá)。 2.豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌和豬巴氏桿菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立。依據(jù)GenBank中的胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的溶血素IVA基因和巴氏桿菌的16SRNA基

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