LPA-,2-調(diào)控LPA誘導的卵巢癌細胞uPA分泌和細胞侵襲的實驗研究.pdf

1、研究背景： 卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤。由于缺乏有效的早期篩查手段，2/3以上的卵巢癌患者就診時已屆晚期，其5年生存率僅為20％～30％，而早期卵巢癌患者的5年生存率可達90％。卵巢癌發(fā)病隱匿，進展迅速，雖然近20年來在卵巢癌治療方面取得了長足進展，卵巢癌手術技巧不斷提高，新型化療藥物、化療方案亦陸續(xù)投入臨床使用，但這些傳統(tǒng)的治療手段均未能顯著改善患者的長期生存率。局部浸潤與轉(zhuǎn)移是關系到卵巢癌臨床治療成敗的關鍵，而侵襲轉(zhuǎn)移

2、又是一個多步驟、多因素參與的極其復雜的過程。因此研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移機制及主要調(diào)控因素意義重大，可以為臨床治療提供新思路和分子治療的靶點。 溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是新近發(fā)現(xiàn)的具有生長因子樣作用的脂類小分子物質(zhì)，主要通過與其特異性G蛋白偶聯(lián)受體結合發(fā)揮多種生物學作用，誘導多種細胞發(fā)生增生性和形態(tài)學改變。許多晚期腫瘤患者的腹水中都可檢測到高水平的LPA。在卵巢癌，研究顯示LPA不僅存在于晚期患

3、者的腹水，在早期患者的血漿中也可檢測到LPA水平升高，且其特異性和敏感性明顯高于CA125。近年發(fā)現(xiàn)LPA及其受體信號通路在許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，如甲狀腺癌、胰腺癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌等?，F(xiàn)已知的LPA受體有5種，LPA1/EDG2、 LPA2/EDG4、LPA3/EDG7，以及最近識別的LPA4/GPR23/p2y9和LPA5/PPARγ。LPA通過與這些受體結合刺激腫瘤細胞的增殖、黏附、侵襲、遷

4、移及侵襲相關細胞因子的分泌。體外研究顯示：LPA1在正常和永生化的卵巢表面上皮細胞中高表達，而LPA2/EDG4，LPA3/EDG7在卵巢癌組織和癌細胞系中高表達，提示LPA受體有望成為卵巢癌治療的新靶點。 尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase plasminogen activator，uPA)是降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)最重要的酶類之一，它在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用已被證實。u

5、PA與卵巢、乳腺和結腸細胞的惡性轉(zhuǎn)化有關。在卵巢癌，細胞內(nèi)uPA的水平與卵巢癌的預后呈負相關。與其他癌癥相比，uPA在卵巢癌組織和腹水中明顯的高表達。 uPA既可通過催化纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶導致基底膜的降解，從而加速癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，也可通過與其特異性受體(urokinase plasminogen activatorreceptor，uPAR)結合刺激細胞的遷移和增殖。研究顯示：LPA能夠上調(diào)卵巢癌細胞uPA的分泌而不影響u

6、PAR的表達，抑制uPA蛋白表達可以明顯降低LPA誘導的卵巢癌細胞的侵襲，因此針對LPA及其與uPA關系的研究將有助于我們更好的了解LPA在卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。 RNA干擾技術作為生物學領域的一種全新的技術，越來越受到廣大研究者的重視并在腫瘤基因治療中有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α＿x擇對腫瘤有治療作用的靶基因是利用RNA干擾技術進行基因治療的關鍵所在。在LPA誘導的腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管其他受體也起作用，但LPA受體2(

7、LPA2)在LPA誘導的侵襲相關因子的分泌中起關鍵作用。故本研究選擇LPA2作為RNA干擾基因治療的靶點。 基于以上報道，本研究首先觀察LPA對人卵巢癌SKOV-3細胞uPA蛋白分泌和細胞侵襲能力的影響；其次，通過脂質(zhì)體介導法將針對LPA2的小干擾RNA轉(zhuǎn)染人卵巢癌SKOV-3細胞，觀察轉(zhuǎn)染后卵巢癌SKOV-3細胞中LPA2 mRNA和蛋白的表達情況；同時研究LPA2受體抑制后對LPA誘導的uPA蛋白分泌、細胞侵襲和遷移能力的影

8、響，探討LPA2受體在LPA誘導的卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。 第一部分溶血磷脂酸對卵巢癌SKOV-3細胞uPA分泌的影響 目的：研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌患者的血漿和腹水中LPA的水平明顯升高，且其水平與卵巢癌的生物學行為有一定的相關性。本研究旨在探討溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)對人卵巢癌SKOV-3細胞尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)分泌和細胞侵襲能力的影響。 方法： 1.常規(guī)

9、培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV-3細胞，加入不同濃度的LPA(0、2、20、40、80μmol/L)作用24小時后，收集細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測溶血磷脂酸作用后，人卵巢癌SKOV-3細胞上清液中uPA蛋白的表達。 2.常規(guī)培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV-3細胞，加入80μmol/L LPA，作用0、3、8、12、24小時后，收集細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測溶血磷脂酸作用后，人卵巢癌SKOV-3細胞

10、上清液中uPA蛋白的表達。 3.常規(guī)培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV-3細胞，加入0或80μmol/L LPA后，利用Matrigel Transwell小室法檢測LPA對SKOV-3細胞體外侵襲能力的影響。 結果： 1.加入不同濃度的LPA，作用24小時后，2μmol/L LPA即可引起uPA分泌增加，但與對照相比無明顯的統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；而加入20、40、80μmol/L LPA后，uPA蛋白分泌量明顯增加(

11、P＜0.001)。 2.加入80μmol/L LPA，作用不同時間后，與對照相比，8小時后LPA誘導的uPA產(chǎn)量即明顯增加(P＜0.01)。 3.Matrigel Transwell小室檢測80gmol/L LPA作用后，穿透人工基底膜的SKOV-3細胞數(shù)較無LPA作用的對照組明顯增多(219.4±23.6 vs.67±10.9)(P＜0.001)。 結論： 1.低濃度的LPA即可誘導uPA分泌增加，且隨

12、著LPA濃度的加大，uPA產(chǎn)量明顯增多,二者間呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。 2.相同濃度LPA作用于SKOV-3細胞，隨著時間的延長uPA分泌量增多，二者間呈現(xiàn)明顯的時間依賴性。 3.LPA可以明顯增加SKOV-3細胞的體外侵襲能力。 目的：運用RNA干擾技術抑制卵巢癌SKOV-3細胞中LPA2基因的表達，觀察LPA2基因沉默對LPA誘導的uPA產(chǎn)量和細胞侵襲、遷移能力的影響，探討RNA干擾技術在抗腫瘤基因治療方面的應

13、用前景以及沉默LPA2基因作為卵巢腫瘤治療靶點的可能性。 方法： 1.復蘇、培養(yǎng)卵巢癌細胞株SKOV-3至對數(shù)生長期，將實驗分成三組，即正常對照組、陰性對照組和干擾組。 2.經(jīng)脂質(zhì)體介導將不同濃度梯度的siRNA轉(zhuǎn)染至SKOV-3細胞中，觀察轉(zhuǎn)染效果，篩選出最佳轉(zhuǎn)染濃度。 3.將特異性siRNA及陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)染至干擾組和陰性對照組，正常對照組未作任何siRNA的轉(zhuǎn)染，僅加轉(zhuǎn)染液。 4.

14、轉(zhuǎn)染36小時后采用半定量RT-PCR和Western blot檢測LPA2 mRNA和蛋白的表達情況。 5.采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測干擾前、后LPA誘導的uPA產(chǎn)量的變化，采用Matrigel Transwell小室法和Transwell Chemotaxis實驗檢測干擾后LPA對卵巢癌細胞體外侵襲和遷移能力的影響。 結果： 1.半定量RT-PCR和Western blot結果顯示siRNA轉(zhuǎn)染后，

15、SKOV-3細胞LPA2 mRNA表達受抑制、蛋白表達水平降低。 2.ELISA結果顯示干擾后80μmol/L LPA誘導的uPA產(chǎn)量下降，干擾組uPA蛋白表達(OD值：0.344±0.039)較陰性對照組uPA蛋白表達(OD值：0.746±0.031)明顯降低(P＜0.001)。 3.Matrigel Transwell小室實驗結果顯示，80μmol/L LPA刺激后，干擾組穿過Matrigel膜的細胞數(shù)(36.2±3

16、.3)，明顯低于陰性對照組(178±17.2)(P＜0.001)。 4.Transwell Chemotaxis實驗結果顯示，80μmol/L LPA刺激后，干擾組進入下室的細胞數(shù)(57±7.6)較陰性對照組(220.4±25.5)明顯下降(P＜0.001)。 結論： 1.針對LPA2基因的特異性siRNA成功轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞后，能夠特異性抑制、降解同源mRNA，有效阻滯LPA2 mRNA和蛋白的表達，可作為