BTLA信號(hào)在T細(xì)胞活化啟動(dòng)和早期階段的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、BTLA是2003年發(fā)現(xiàn)的Ig家族成員，是與CTLA-4及PD-1類(lèi)似的抑制性受體。人的BTLA基因定位于染色體3q13.2，與小鼠具有48％的同源性。BTLAmRNA在脾臟及淋巴結(jié)組織中高表達(dá)，在腎臟、肝臟、肺、腦、心臟及肌肉等組織中表達(dá)量都很低，甚至不表達(dá)。BTLA廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞表面。
　　 BTLA含有一個(gè)信號(hào)序列、一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)樣的胞外段、跨膜區(qū)和大約100個(gè)氨基

2、酸的胞漿區(qū)。BTLA胞漿區(qū)存在3個(gè)重要的含酪氨酸殘基的基序:潛在的Grb2結(jié)合位點(diǎn)，免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序。研究表明，BTLA與其配體HVEM結(jié)合可以抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，推遲細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而抑制或終止免疫應(yīng)答。在持續(xù)的抗原刺激下，BTLA高度選擇性表達(dá)在無(wú)能CD4+T細(xì)胞上，表明BTLA信號(hào)在誘導(dǎo)與維持T細(xì)胞無(wú)能狀態(tài)的過(guò)程中有重要作用。另外，BTLA不僅在在維持外周免疫耐受中具有重要作用，還可以

3、預(yù)防自身免疫疾病的發(fā)生，終止炎癥反應(yīng)，抑制移植免疫應(yīng)答。
　　 BTLA在初始和活化T細(xì)胞上都有表達(dá)，因此，Murphy提出BTLA可能在T細(xì)胞活化的各個(gè)階段尤其是早期階段發(fā)揮作用。本研究首先分析了BTLA-HVEM順式復(fù)合物的存在對(duì)細(xì)胞表面BTLA分子表達(dá)水平檢測(cè)的影響，進(jìn)而研究了BTLA在T細(xì)胞活化起始和早期階段的調(diào)節(jié)作用。
　　 一、BTLA-HVEM順式復(fù)合物對(duì)細(xì)胞表面BTLA分子檢測(cè)的影響
　　 [目的

4、]T細(xì)胞和U937細(xì)胞表面存在BTLA和HVEM共表達(dá)的現(xiàn)象。探討B(tài)TLA-HVEM順式復(fù)合物存在對(duì)細(xì)胞表面BTLA分子檢測(cè)的影響。
　　 [方法]分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)陰性選擇磁珠分離純化獲得T淋巴細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)的方法，用抗不同BTLA位點(diǎn)的商品化單抗MIH26和本室研制的單抗8H9分別檢測(cè)U937和T細(xì)胞等細(xì)胞表面BTLA分子的表達(dá)水平。293T/BTLA基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞上BTLA分子的檢測(cè)采用8H9單抗。
　　

5、 [結(jié)果]商品化單抗MIH26(0.5μg)檢測(cè)T細(xì)胞和U937細(xì)胞上BTLA分子的表達(dá)量分別為90％以上，而8H9單抗（1μg）檢測(cè)到二者的表達(dá)水平分別為42.2％、30.8％。采用0.02μg和0.05μg的8H9單抗檢測(cè)293T/BTLA轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，顯示BTLA分子的表達(dá)量分別為80％和91.4％。
　　 [結(jié)論]T細(xì)胞和U937細(xì)胞上共表達(dá)的BTLA和HVEM形成順式復(fù)合物，影響8H9對(duì)BTLA的檢測(cè)，而不影響MIH

6、26的檢測(cè)。
　　 二、BTLA對(duì)T細(xì)胞活化啟動(dòng)和早期階段的調(diào)節(jié)作用。
　　 [目的]觀察BTLA在T細(xì)胞活化過(guò)程中的表達(dá)變化，探討其在T細(xì)胞活化各個(gè)階段尤其是早期階段的抑制作用。
　　 [方法]分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)磁珠分選獲得純化的T細(xì)胞。用激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體刺激T細(xì)胞活化，采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)BTLA、CTLA-4和PD-1在T細(xì)胞活化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體在加入B

7、TLA單抗8H9的情況下刺激T細(xì)胞活化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞活化早期標(biāo)志分子CD25和CD69的表達(dá)。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體聯(lián)合HVEM-Fc或者BTLA單抗8H9，觀察BTLA信號(hào)在活化后的不同時(shí)間對(duì)T細(xì)胞增殖的作用。同時(shí)，采用ELISA方法檢測(cè)8H9對(duì)CD3單抗聯(lián)合CD28單抗刺激的T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的影響。預(yù)先用CD3和CD28抗體刺激T細(xì)胞活化后，在24h，48h，72h分別加入8H9抗體并交聯(lián)，觀察缺失BT

8、LA信號(hào)對(duì)T細(xì)胞活化抑制的減弱程度。
　　 [結(jié)果]BTLA在T細(xì)胞上組成性高表達(dá)，活化后表達(dá)有所降低，然后迅速回升;CTLA-4在靜止T細(xì)胞上不表達(dá)，PD-1的表達(dá)水平很低，二者都是活化后被誘導(dǎo)表達(dá)。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體聯(lián)合8H9刺激T細(xì)胞后，CD25和CD69的表達(dá)均受到抑制。激發(fā)型CD3抗體和CD28抗體聯(lián)合8H9或者HVEM-Fc刺激后，在刺激后的1d，2d，3d，4d檢測(cè)，均對(duì)T細(xì)胞有抑制作用。同時(shí)，8H9對(duì)