β-arrestins在細胞凋亡和TLR4介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)中分子調(diào)控機制的研究.pdf

1、第一部分：β-arrestins負性調(diào)控細胞凋亡
　　目的:
　　研究β-arrestins在血清饑餓（SD）誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）凋亡中的作用，以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　方法:
　　WT，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs在無血清DMEM培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12h、24h、48h后，TUNEL檢測細胞凋亡率。β-arrestin2 KO MEFs轉(zhuǎn)染β-arrest

2、in2過表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后，SD誘導(dǎo)12h，24h、48h，TUNEL檢測細胞凋亡情況。SD誘導(dǎo)12h、24h后，Westernblot檢測WT，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs內(nèi)Caspase-3、ERK1/2、p38MAPKs、Akt蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.SD誘導(dǎo)不同時間后，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs中凋亡細胞數(shù)目顯著多于W

3、T MEFs，并且在β-arrestin2 KO MEFs中轉(zhuǎn)染β-arrestin2質(zhì)粒后能夠明顯減少細胞的凋亡。
　　2. SD誘導(dǎo)不同時間后，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs中cleaved Caspase-3活性顯著高于WT MEFs。
　　3. SD誘導(dǎo)不同時間后，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs中p-ERK1/2、p-p38MAPKs水平顯著

4、高于WT MEFs，而p-Akt則明顯低于WT MEFs。
　　結(jié)論：
　　1.β-arrestin1和2能夠顯著減少SD誘導(dǎo)的MEFs的凋亡。
　　2.β-arrestin1和2通過調(diào)控促凋亡蛋白ERK1/2、p38MAPKs和抗凋亡蛋白Akt的信號途徑參與SD介導(dǎo)的細胞凋亡信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　第二部分:β-arrestins負性調(diào)控TLR4介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)
　　目的:
　　研究β-arres

5、tins在脂多糖（LPS）、IL-1β誘導(dǎo)的MEFs、HEK293細胞炎癥介質(zhì)產(chǎn)生中的作用，以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　方法:
　　LPS刺激WT，β-arrestin1/2 DKO MEFs不同時間點后，RT-PCR測定細胞因子IL-6、IL-8和 TNF-α的表達水平。β-arrestin1/2 DKO MEFs分別轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2過表達質(zhì)粒48h后，LPS刺激1h，RT-PCR及ELI

6、SA測定細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平，Westernblot測定細胞內(nèi)ERK1/2、p38MAPKs、Akt的蛋白表達情況。IL-1β刺激HEK293細胞、轉(zhuǎn)染了β-arrestin1或2過表達質(zhì)粒的HEK293細胞及轉(zhuǎn)染了β-arrestin1或2 siRNA的HEK293細胞后，雙熒光素酶報告基因檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的活性。
　　結(jié)果:
　　1. LPS刺激后，β-arrestin1/2

7、DKO MEFs中IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平顯著高于WT MEFs，并且在β-arrestin1/2 DKO MEFs中轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2質(zhì)粒后能夠明顯減少IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平。
　　2. LPS刺激后，β-arrestin1/2 DKO MEFs中p-ERK1/2、p-p38MAPKs水平顯著高于 WT MEFs，轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2

8、質(zhì)粒后則能顯著抑制 p-ERK1/2、p-p38MAPKs的活性。
　　3. IL-1β刺激HEK293細胞后，能引起NF-κB及AP-1報告基因活性的增加，轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2質(zhì)粒后能夠抑制報告基因活性的增加。而轉(zhuǎn)染了β-arrestin1或β-arrestin2 siRNA后則能進一步增加NF-κB及AP-1報告基因活性。
　　結(jié)論:
　　1.β-arrestin1和2能夠抑制LPS引

9、起的細胞因子的表達，負調(diào)控TLR4介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)。
　　2.β-arrestin1和2是通過抑制ERK、p38MAPKs來負調(diào)控TLR4的信號通路。
　　3.β-arrestin1和2能夠調(diào)控IL-1β引起的NF-κB及AP-1的激活
　　第三部分：β-arrestin2在TLR4介導(dǎo)的小鼠肝臟缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)及細胞凋亡中的作用及機制研究
　　目的:
　　研究β-arrestin2在TLR4介導(dǎo)

10、的小鼠肝臟缺血再灌注損傷中的保護作用及其可能機制。
　　方法:
　　C57BL/6β-arrestin2 WT、KO雄性小鼠隨機分為四組，兩組對照組（WT、β-arrestin2 KO）和兩組實驗組（IR+WT、IR+β-arrestin2 KO）。制作小鼠肝臟熱缺血再灌注模型，再灌注6小時后處死小鼠，檢測肝臟功能、肝組織形態(tài)學(xué)、肝細胞凋亡、細胞因子、生存率等指標(biāo)。Westernblot檢測TLR4、Akt/GSK3β， B

11、cl-2家族，MAPKs及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達。
　　結(jié)果:
　　1.再灌注6小時，β-arrestin2 KO組ALT、AST，細胞凋亡數(shù)目及細胞因子的產(chǎn)生顯著高于WT組，β-arrestin2 KO組小鼠生存率明顯低于WT組。
　　2. Westernblot檢測β-arrestin2 KO組 Akt/GSK、Bcl-2的活性顯著低于 WT組，而ERK1/2、p38MAPKs、NF-κB的活性高于WT組。