孕期乙醇暴露對(duì)大鼠腦內(nèi)TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答的影響.pdf

1、乙醇可影響大腦發(fā)育,孕期乙醇暴露可誘發(fā)新生兒神經(jīng)發(fā)育遲滯及精神發(fā)育障礙,是最主要的預(yù)測出生缺陷的因素之一。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)、滋養(yǎng)神經(jīng)元的作用,也是神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞。血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的存在使中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)與外界的物質(zhì)交換受到了嚴(yán)格的限制。CNS的固有免疫反應(yīng)與多種神經(jīng)和精神性疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。TLR4(toll-l

2、ike receptor4)是CNS固有免疫應(yīng)答識(shí)別抗原物質(zhì)的重要分子,目前對(duì)TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答通路的研究已較為廣泛和深入,但乙醇暴露對(duì)該通路是否存在影響仍無定論。本研究圍繞CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答反應(yīng),分三個(gè)部分探討孕期乙醇暴露對(duì)新生兒CNS發(fā)育的影響。
　　第一部分:分別于新生大鼠(生后1,3,7,14,21天)側(cè)腦室(0.3 mg/kg,1mg/ml)和腹腔內(nèi)(0.3 mg/kg,1mg/ml)注射小劑量脂

3、多糖(lipopolysaccharide,LPS),12小時(shí)后以實(shí)時(shí)定量 PCR及 Western Blot檢測全腦中 TLR4 mRNA以及 myeloid differentiation factor88(MyD88),nuclear factor-kappa Bp50(NF-κBp50)蛋白的表達(dá)。并于新生大鼠(生后1,3,7天)腹腔和側(cè)腦室注射LPS(劑量同前),12小時(shí)后腦部切片行Iba-1和RECA雙標(biāo)的免疫熒光染色。伊文

4、思藍(lán)(evans blue,EB)滲透實(shí)驗(yàn)觀察新生大鼠(生后1,3,7天)腹腔注射LPS(0.3 mg/kg,0.01mg/ml)12小時(shí)后全腦切片是否有EB的滲出。透射電鏡觀察新生大鼠(生后1,3天)腹腔注射LPS(0.3 mg/kg,0.01mg/ml)12小時(shí)后腦部超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果:即使在出生后1天內(nèi),新生大鼠 CNS也能對(duì)腦內(nèi)注射的LPS做出強(qiáng)烈反應(yīng)。TLR4 mRNA以及MyD88,NF-κBp50蛋白的表達(dá)量

5、顯著升高,Iba-1特異性標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,并且激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分布于腦內(nèi)各處,與RECA所標(biāo)記的毛細(xì)血管的位置無關(guān)。而腹腔內(nèi)小劑量注射LPS卻不能激活CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)。腹腔內(nèi)小劑量注射LPS12小時(shí)后,掃描新生大鼠全腦各個(gè)層面均未發(fā)現(xiàn)有EB滲出的跡象,且腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)都基本正常。
　　第二部分:建立孕期乙醇暴露大鼠模型,3組孕鼠從受孕開始整個(gè)孕期分別進(jìn)食酒精流體飼料,對(duì)照組流體飼料和

6、普通固體飼料。從子代大鼠出生后第27天開始對(duì)孕期乙醇暴露組與對(duì)照組子代大鼠腹腔注射Brdu(200mg/kg),連續(xù)注射3天,第四天(生后30天)免疫熒光染色檢測大鼠腦內(nèi)抗Brdu與Doublecortin表達(dá)情況。同時(shí)給予三組子代大鼠(生后30天)側(cè)腦室立體定位注射LPS(0.3 mg/kg,1mg/ml)12小時(shí)后Western Blot檢測大鼠腦組織中9種蛋白(TLR4,MyD88,TRAF6,TRIF,NF-κBp50,pI-κ

7、B,TNFα,IL-1β,IFN)的表達(dá)量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Western Blot的結(jié)果,我們做了TRAF6、TRIF分別與NF-κB雙標(biāo)的免疫熒光染色,觀察孕期乙醇暴露組與對(duì)照組子代大鼠在側(cè)腦室立體定位注射LPS前后這三種分子的表達(dá)情況的變化及分布。
　　結(jié)果:孕期乙醇暴露組與對(duì)照組子代大鼠(生后30天)Doublecortin標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量與分布無明顯變化,與Brdu雙標(biāo)的新生成的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量與分布也未觀察到到明

8、顯變化。對(duì)照組子代大鼠在LPS刺激12小時(shí)后全腦中9種蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào);而孕期乙醇暴露組子代大鼠在LPS刺激12小時(shí)后全腦中TLR4,TRIF和IFN的表達(dá)水平與對(duì)照組相比降低,MyD88,TRAF6,NF-κBp50,pI-κB,TNFα和IL-1β的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。TLR4,MyD88,TRAF6,pI-κB和NF-κBp50的基礎(chǔ)表達(dá)量(未給予LPS刺激)在各組子代大鼠間沒有顯著差異,而TRIF,TNFα,IL-1β和

9、IFN的表達(dá)量,孕期乙醇暴露組顯著高于對(duì)照組。免疫熒光染色結(jié)果顯示對(duì)照組30天子代大鼠側(cè)腦室注射LPS12小時(shí)后海馬齒狀回TRAF6,TRIF和NF-κB的表達(dá)水平均顯著升高;而孕期乙醇暴露組則沒有觀察到顯著變化。
　　第三部分;分別給予3組子代大鼠(生后30天)側(cè)腦室立體定位注射 MyD88抑制肽及其對(duì)照肽,12小時(shí)后Western Blot檢測大鼠全腦中TLR4、NF-κBp50、pI-κB3種蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果

10、:對(duì)照組子代大鼠側(cè)腦室注射MyD88抑制肽12小時(shí)后 TLR4、NF-κBp50、pI-κB的蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào);而孕期乙醇暴露組未見顯著差異。
　　總結(jié)論:(1)新生大鼠(即使剛出生1天)CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答已基本完備,且新生大鼠BBB的結(jié)構(gòu)和功能也已基本完備;(2)孕期乙醇暴露對(duì)新生大鼠CNS發(fā)育的形態(tài)學(xué)影響有限;(3)孕期乙醇暴露子代大鼠CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答的受到抑制,同時(shí)孕期乙醇暴露可使子代大

11、鼠腦內(nèi)部分炎性因子基礎(chǔ)表達(dá)量上調(diào),如TRIF,TNFα,IL-1β和IFN;(4)孕期乙醇暴露可影響子代大鼠CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本研究表明孕期乙醇暴露可影響子代大鼠CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)。雖然機(jī)制尚未明確,但在此基礎(chǔ)上的進(jìn)一步研究定會(huì)有助于深入認(rèn)識(shí)孕期乙醇暴露對(duì)新生兒 CNS發(fā)育的影響,并可能找到阻斷這種影響的有效途徑,減少新生兒 CNS出生缺陷的發(fā)生率,做到優(yōu)生優(yōu)育。甚至還可能為治療慢