Atg5在TLR4介導(dǎo)蓖麻毒素?fù)p傷中的作用機制研究.pdf

1、蓖麻毒素(ricin toxin，RT)是大戟科蓖麻屬植物——蓖麻(ricin)分離出的毒素蛋白。它由A、B兩條鏈組成。其中，A鏈能夠與真核細(xì)胞核糖體28S rRNA腺苷殘基(A4324)高度特異性結(jié)合，發(fā)生脫嘌呤作用，形成次黃嘌呤-蓖麻毒素環(huán)(sarcin-ricin loop，SRL)，抑制蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮毒性作用。蓖麻毒素能夠引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而氧化應(yīng)激和炎癥的過程又會引起細(xì)胞自噬的發(fā)生。

2、>　　自噬是真核細(xì)胞高度保守的一種生存機制。它能夠通過選擇性或非選擇性降解細(xì)胞蛋白、細(xì)胞器或病原微生物，并將降解后的產(chǎn)物再利用，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。自噬的標(biāo)志性物質(zhì)是表面附有LC3蛋白的自噬體的形成。自噬體是一種雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠包裹及運輸待降解物質(zhì)的小囊泡，常在細(xì)胞受刺激后15-30min內(nèi)即可被檢測。自噬根據(jù)發(fā)生過程的不同又可分為三類，即大自噬、微自噬、分子伴侶介導(dǎo)自噬?！凹?xì)胞自噬”通常都指大自噬。大自噬的發(fā)生過程包括誘導(dǎo)、形成、

3、運輸和融合、降解四個階段。當(dāng)細(xì)胞受到有害刺激，多種信號通路交互作用激活自噬信號通路，激活Beclin-1形成自噬泡即為誘導(dǎo)階段。隨后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ在Atg7的作用下向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，經(jīng)Atg5-Atg12引導(dǎo)從而附著在自噬泡上。自噬泡延伸拓展，選擇性或非選擇性地將待降解物包裹形成自噬體，即為形成階段。自噬體通過多種蛋白的協(xié)同定位作用可與吞噬體融，并最終與溶酶體進(jìn)行融合，形成自噬溶酶體，即運輸融合階段。自噬溶酶體將待降解物通過酶促反應(yīng)

4、進(jìn)行降解。隨后自噬溶酶體裂解，并被其他細(xì)胞器再回收利用，完成降解階段。
　　Toll樣受體屬于模式識別受體，有13個家族成員，人類有10個(TLR1-10)，而小鼠有12個(TLR1-9，TLR11-13)。根據(jù)接頭蛋白的不同，可以將Toll樣受體信號通路分為MyD88信號通路和TRIF信號通路。TLR4的MyD88信號通路是在TLR4被激活后，MyD88與IRAK形成Myddosome復(fù)合體。隨后IRAK1從MyD88上分離，催

5、化TRAF6發(fā)生聚泛素化。TRAF6與UBC13、UEV1A共同作用下，催化TAK1的聚泛素化，從而激活MAPK信號通路和NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。而TLR4的IRAK信號通路需要TRAM進(jìn)行受體蛋白分選，再經(jīng)過TRIF自身低聚化而激活，使得TRAF6和TRAF3發(fā)生聚泛素化，并進(jìn)一步募集IKKε和TBK1，引起IRF3磷酸化，最終引起Ⅰ型IFN基因表達(dá)。
　　Toll樣受體信號通路與自噬信號通路之間存在交互作用。T

6、oll樣受體信號通路的活化能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，而自噬又能通過激活酶活性或調(diào)控細(xì)胞因子分泌反饋性調(diào)控Toll樣受體信號通路。已經(jīng)證實TLR4的下游MyD88、TRIF、TAK1等接頭蛋白能與Beclin1、Bcl-2共同調(diào)節(jié)自噬信號通路。Atg5作為巨自噬和微自噬的必要的基因標(biāo)志，在自噬過程中起到重要作用。
　　目前，對蓖麻毒素作用機制的研究主要圍繞凋亡，未見自噬相關(guān)報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素能夠激活巨噬細(xì)胞TLR4信號通路

7、。本研究以探索Atg5在TLR4介導(dǎo)蓖麻毒素?fù)p傷中的作用機制為目的，以期為蓖麻毒素的功能開發(fā)及中毒救治提供新的參考思路。本課題包括以下方面:
　　(1)蓖麻毒素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞自噬的作用
　　本課題測量了蓖麻毒素對RAW264.7的IC50約為100 ng/mL，確定使用十分之一IC50即10 ng/mL的蓖麻毒素為自噬誘導(dǎo)劑量，并通過Western blot方法檢測該劑量誘導(dǎo)不同時間細(xì)胞自噬的通量，最終確定蓖麻毒素

8、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的條件:細(xì)胞密度2.5×105個/mL的RAW264.7細(xì)胞，10 ng/mL蓖麻毒素誘導(dǎo)2h。
　　(2)蓖麻毒素對Atg5基因表達(dá)的影響
　　通過用蓖麻毒素處理RAW264.7，本課題通過PCR對Atg5蛋白進(jìn)行檢測。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)后，Atg5表達(dá)量增高，變化規(guī)律與LC3正相關(guān)，2h為峰值。
　　(3)Atg5對蓖麻毒素激活TLR4信號通路的影響
　　本課題通過將psiRNA-mAtg5

9、質(zhì)粒和psiRNA-LucGL3對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入RAW264.7，通過抗生素篩選，建立了Atg5基因沉默的RAW264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和對照質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。經(jīng)過PCR和Western blot驗證，Atg5基因沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系A(chǔ)tg5的基因沉默率約為49.4％，蛋白沉默率約為89.7％。
　　本課題通過Western blot對蓖麻毒素誘導(dǎo)RAW264.7自噬后的TLR4信號通路TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測，并與

10、正常RAW264.7細(xì)胞相比較。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)后TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)量明顯增高，TRIF蛋白的表達(dá)量變化不明顯。這說明蓖麻毒素能夠激活TLR4信號通路，并且激活TLR4信號通路下游MyD88信號通路，而對TRIF信號通路無影響。
　　基于Atg5基因沉默的RAW264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過Western blot對Atg5基因沉默的RAW264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的TLR4信號通路TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)

11、量進(jìn)行檢測，并與正常RAW264.7細(xì)胞相比較。實驗發(fā)現(xiàn)，基因沉默Atg5后，TLR4、MyD88、TRIF蛋白的表達(dá)量均提高。
　　通過對Atg5基因沉默的RAW264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬后，進(jìn)行Western blot檢測TLR4信號通路TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)量變化。發(fā)現(xiàn)此時的蛋白變化并無規(guī)律性。其中，TLR4蛋白略有降低而MyD88、TRIF蛋白無明顯變化。并且，同樣用蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬，Atg5基

12、因沉默的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，在TLR4信號通路TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)量變化上也呈現(xiàn)出無規(guī)律性。其中TLR4和MyD88蛋白略有降低而，TRIF蛋白則顯著增高。
　　鑒于已有文獻(xiàn)報道自噬能夠抑制炎癥因子的產(chǎn)生及ROS的活性，綜合考慮實驗結(jié)果、自噬的作用及蓖麻毒素本身的毒理作用，對Atg5基因沉默經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬后TLR4相關(guān)蛋白表達(dá)的無規(guī)律性進(jìn)行解釋:Atg5能夠反饋性抑制TLR4的活性。故基因敲除Atg5后TLR

13、4相關(guān)蛋白表達(dá)均增高。當(dāng)蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后，TLR4相關(guān)蛋白的表達(dá)應(yīng)該增高。而實驗結(jié)果為TLR4蛋白略有降低而MyD88、TRIF蛋白無明顯變化。這可能是由于蓖麻毒素對蛋白質(zhì)合成抑制起主導(dǎo)作用，而基因敲除Atg5對TLR4信號通路的活性增強作用更弱。該推論也能解釋經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬的Atg5基因沉默細(xì)胞較經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬的正常細(xì)胞，TLR4和MyD88表達(dá)量略有降低。但TRIF蛋白表達(dá)量明顯增高，則可能存在其他信號通路對TRIF的