雙環(huán)醇對(duì)Con A肝損傷小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響;雙環(huán)醇對(duì)順鉑中毒小鼠腎臟及肝臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)于干擾素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中，是細(xì)胞因子信息內(nèi)傳的一條重要通道，涉及免疫、炎癥等多種生理、病理過(guò)程。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在體內(nèi)多種生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，不僅參與細(xì)胞增殖信號(hào)傳遞，也是調(diào)控細(xì)胞炎癥和應(yīng)激信號(hào)的重要蛋白。 雙環(huán)醇(商品名：百賽諾，Bicyclol；化學(xué)名：4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-雙(亞甲二氧基)-2-羥甲基-2’-甲氧羰基聯(lián)苯)是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的

2、抗肝炎新藥。前期藥理研究表明，雙環(huán)醇對(duì)多種化學(xué)性和免疫性肝損傷均有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其肝保護(hù)作用機(jī)制與抑制氧化損傷及炎癥因子調(diào)控密切相關(guān)。但雙環(huán)醇上述作用與JAK/STAT及MAPKs細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系尚不完全明了。 本研究擬觀察免疫性(ConA)肝損傷及HBVDNA轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟JAK/STAT細(xì)胞信號(hào)通路變化，以及雙環(huán)醇對(duì)JAK/STAT細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控作用。同時(shí)本研究觀察雙環(huán)醇對(duì)順鉑引起肝腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

3、第一部分雙環(huán)醇對(duì)ConA肝損傷小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響 1.雙環(huán)醇對(duì)ConA肝損傷小鼠肝臟TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響本研究應(yīng)用ConA免疫性肝損傷動(dòng)物模型，觀察病理狀態(tài)下TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控及雙環(huán)醇對(duì)TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1的影響，進(jìn)一步探討雙環(huán)醇調(diào)控肝臟免疫炎癥因子表達(dá)失衡的分子機(jī)制。

4、 小鼠尾靜脈注射ConA(25mg/kg)可引起急性肝損傷，表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶升高及肝組織出現(xiàn)嚴(yán)重壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。雙環(huán)醇口服給藥(200mg/kg，qd×4)可顯著降低ConA引起的小鼠血清ALT及AST異常增高，肝組織形態(tài)學(xué)改變也明顯改善。 ConA引起肝損傷的發(fā)病機(jī)制中，炎癥因子的水平升高是產(chǎn)生損傷的主要因素。注射ConA后，小鼠血清炎癥因子TNF-α及IFN-γ水平顯著升高，分別于2h及8h達(dá)峰。雙環(huán)醇預(yù)防給藥可抑制C

5、onA引起的血清TNF-α及IFN-γ水平升高，并下調(diào)IFN-γmRNA在肝組織的表達(dá)。 IKB的降解及NF-κB表達(dá)上調(diào)是TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要環(huán)節(jié)。活化的NF-κB可通過(guò)誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，產(chǎn)生大量NO，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。ConA注射后1h，小鼠肝臟IκB水平即有降低，NF-κB水平同時(shí)升高，導(dǎo)致小鼠肝臟iNOS水平升高，血清NO含量增加。雙環(huán)醇可抑制ConA肝損傷小鼠肝臟IκB降解和NF-κB表達(dá)升高，下調(diào)肝臟iNOS水

6、平，從而顯著抑制血清NO異常升高。 在IFN-γ介導(dǎo)的免疫性肝損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，IFN-γ主要通過(guò)誘導(dǎo)STAT-1同源二聚體的生成而參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。小鼠注射ConA后，肝臟pSTAT1水平升高，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游因子IRF-1和負(fù)反饋抑制因子SOCS1表達(dá)也同時(shí)上調(diào)。雙環(huán)醇在保護(hù)肝損傷的同時(shí)可抑制小鼠肝臟pSTAT1及IRF-1的表達(dá)，同時(shí)，進(jìn)一步上調(diào)肝臟SOCS1表達(dá)。已知黏附分子ICAM-1/LFA-1可介導(dǎo)肝臟炎性反應(yīng)時(shí)的細(xì)

7、胞黏附，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。小鼠注射ConA后，肝組織ICAM-1及其受體LFA-1的表達(dá)明顯增加，雙環(huán)醇可明顯抑制上述細(xì)胞因子在肝組織的異常表達(dá)。 本研究還采用基因芯片技術(shù)研究雙環(huán)醇口服給藥對(duì)小鼠肝臟基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果表明，雙環(huán)醇給藥后小鼠肝臟287條基因發(fā)生差異表達(dá)，占芯片基因總數(shù)的7％，其中表達(dá)下調(diào)基因166條，上調(diào)基因121條。差異表達(dá)的基因涉及代謝、離子通道及細(xì)胞色素P450相關(guān)基因45條；炎癥與應(yīng)激、凋亡相關(guān)基因32

8、條；免疫相關(guān)基因11條：細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)及再生相關(guān)基因27條；疾病特異表達(dá)基因與原癌基因14條；其他功能基因26條。上述結(jié)果將為后續(xù)研究提供參考。 本研究結(jié)果表明，雙環(huán)醇對(duì)ConA引起肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制與下調(diào)炎癥因子TNF-α、IFN-γ水平，抑制STAT1磷酸化及上調(diào)STAT1的負(fù)反饋抑制因子SOCS1的表達(dá)，阻斷IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。雙環(huán)醇還可通過(guò)抑制IκB降解及NF-κB活化而降低iNOS表達(dá)，繼而減少Con

9、A引起的NO水平升高。 2.雙環(huán)醇對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBVDNA復(fù)制及JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 已知抗肝炎病毒藥物除可直接抑制HBVDNA聚合酶，還可通過(guò)活化NKT細(xì)胞和CTL細(xì)胞功能，誘導(dǎo)干擾素合成，和/或活化干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)抗病毒蛋白的合成。上述兩種途徑都涉及到干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白(JAK/STAT)的活化和轉(zhuǎn)位。本研究應(yīng)用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及HepG2.2.1.5細(xì)胞研究雙環(huán)醇對(duì)HBVDNA復(fù)

10、制影響與JAK/STAT信號(hào)通路的關(guān)系。 研究結(jié)果表明，雙環(huán)醇可降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBVDNA水平(5×103copies/mlvs6×105copies/ml)。此外，雙環(huán)醇對(duì)HepG2.2.1.5HBVDNA復(fù)制也有一定抑制作用(1.5×105copies/mlvs4.5×105copies/ml)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清IFN-γ水平及肝臟pSTAT1/3，IRF-1表達(dá)未見(jiàn)顯著變化，雙環(huán)醇對(duì)上述指標(biāo)亦無(wú)

11、影響。 上述結(jié)果提示，雙環(huán)醇對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBVDNA復(fù)制有一定抑制作用，但此作用與調(diào)控JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無(wú)明顯相關(guān)性。 第二部分雙環(huán)醇對(duì)順鉑中毒小鼠肝臟及腎臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究順鉑是臨床上常用的廣譜抗癌藥，但其導(dǎo)致的肝腎損傷影響其臨床應(yīng)用和療效，目前尚無(wú)滿意的治療藥物。本研究模擬臨床常規(guī)的給藥方式，建立了順鉑引起小鼠肝、腎損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究雙環(huán)醇對(duì)順鉑肝腎損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制，并觀察雙環(huán)醇

12、在保護(hù)順鉑肝腎毒性的同時(shí)對(duì)順鉑抗腫瘤作用的影響，為臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 雙環(huán)醇對(duì)順鉑引起的肝腎損傷具有較好的保護(hù)作用，不僅可明顯降低順鉑引起的血清CRE/BUN和轉(zhuǎn)氨酶的升高，腎臟和肝臟病理?yè)p傷也明顯減輕。 小鼠腹腔注射順鉑后，肝臟與腎臟抗氧化物SOD，CAT及GSH-px活性均顯著降低，GSH含量也顯著下降，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA顯著升高。雙環(huán)醇可抑制肝腎組織內(nèi)MDA的升高和GSH的下降，SOD、CAT及GS

13、H-px活性也明顯改善。同時(shí)，雙環(huán)醇可阻斷順鉑中毒小鼠肝臟iNOS的表達(dá)升高，降低肝臟NO水平，抑制肝臟3-NT的過(guò)表達(dá)。此外，雙環(huán)醇可阻斷順鉑引起肝臟ERK1/2、Elk-1、p38MAPK、p53的磷酸化及calpain異常激活。雙環(huán)醇在保護(hù)順鉑引起肝腎損傷的同時(shí)，對(duì)順鉑的抑瘤率無(wú)明顯影響(H22腫瘤抑制率：順鉑單用85.7％，與雙環(huán)醇250mg/kg合用83.5％)。 由此可見(jiàn)，雙環(huán)醇對(duì)順鉑引起肝腎損傷的保護(hù)作用可歸納為抑

14、制氧化損傷，恢復(fù)抗氧化物水平達(dá)到細(xì)胞保護(hù)作用。同時(shí)，雙環(huán)醇可抑制順鉑引起的肝臟iNOS表達(dá)上調(diào)，降低NO水平從而抑制氧化與硝化應(yīng)激，阻斷蛋白質(zhì)硝基化。雙環(huán)醇抑制氧化與硝化應(yīng)激與調(diào)控肝臟p38MAPK及ERK1/2活化及其下游因子激活密切相關(guān)。 綜上所述，雙環(huán)醇對(duì)上述免疫性和藥物性肝損傷的保護(hù)作用與JAK/STAT及MAPKs細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系可歸納如下： 1.雙環(huán)醇可通過(guò)調(diào)控TNF-α/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制Iκ

15、B降解及NF-κB活化，從而降低ConA引起的小鼠肝臟iNOS表達(dá)上調(diào)及NO生成。 2.雙環(huán)醇可抑制ConA引起的STAT1及其下游前凋亡因子IRF-1的活化，上述作用是通過(guò)上調(diào)SOCS1實(shí)現(xiàn)。 3.雙環(huán)醇對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及HepG2.2.1.5細(xì)胞HBVDNA復(fù)制的抑制作用與JAK/STAT細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無(wú)關(guān)。 4.雙環(huán)醇對(duì)順鉑引起的小鼠肝腎損傷均有明顯的保護(hù)作用，上述作用與雙環(huán)醇抑制順鉑引起的肝腎氧化/硝

16、化應(yīng)激相關(guān)。 5.雙環(huán)醇對(duì)順鉑肝腎損傷的保護(hù)作用與調(diào)控ERK1/2及p38MAPK及其下游因子有關(guān)。 6.雙環(huán)醇在保護(hù)順鉑中毒小鼠肝、腎損傷的同時(shí)不影響順鉑對(duì)H22實(shí)體瘤的抑制作用。 本研究從保護(hù)免疫性和藥物性肝損傷的角度進(jìn)一步豐富了對(duì)雙環(huán)醇作用分子機(jī)制的了解，發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇可通過(guò)抑制炎癥因子表達(dá)及抗氧化/硝化應(yīng)激而保護(hù)肝細(xì)胞損傷，其保護(hù)機(jī)制與調(diào)控JAK/STAT及MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。上述結(jié)果為臨床適應(yīng)癥