清肝化瘀方藥對大鼠肝癌前病變的阻斷作用及對Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在我國每年約有10萬人新患此病，其死亡率在我國惡性腫瘤中居第二位。目前手術(shù)切除仍是治療肝癌的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，遠(yuǎn)期療效不明確，治療頗為棘手。近年來，隨著綜合治療概念的確立，中醫(yī)藥積極參與肝癌的臨床防治，有計(jì)劃地與手術(shù)治療、放療、化療相結(jié)合，可明顯減少不良反應(yīng)，使肝癌總體療效得到了進(jìn)一步提高。清肝化瘀方藥為姚樹坤教授根據(jù)祖國

2、傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論和多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的治療肝癌的經(jīng)驗(yàn)方，該方以解毒利濕、破瘀散結(jié)、健脾行氣為法則，以往臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)對肝硬化、肝癌有明顯的阻斷作用，可從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)抑制腫瘤形成和進(jìn)展。 目前公認(rèn)的腫瘤發(fā)生模式是多基因突變、多因素、多途徑、多步驟的過程，在此過程中一些重要的生長因子及其受體通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制著細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡等所有活動(dòng)。細(xì)胞信號傳導(dǎo)異常，會導(dǎo)致腫瘤快速增殖、無限生長。隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的發(fā)展

3、，信號傳導(dǎo)在腫瘤形成過程中的作用正在逐步被闡明，信號傳導(dǎo)通路已成為抗腫瘤藥物研究的新靶點(diǎn)。最新研究發(fā)現(xiàn)Notch信號傳導(dǎo)通路在許多腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于其對肝癌及肝癌前病變期作用的報(bào)道尚不多見。近年來，肝癌前病變期的特殊病理改變逐漸引起了國內(nèi)外學(xué)者的注意，發(fā)現(xiàn)此階段雖然細(xì)胞形態(tài)尚未發(fā)生明顯改變，但已出現(xiàn)一些酶學(xué)及蛋白表達(dá)異常，這些細(xì)胞在某些因素持續(xù)作用下可發(fā)生癌變，故深入研究此階段的病理機(jī)制，為早期干預(yù)逆轉(zhuǎn)這種初始病變、阻斷肝

4、癌形成提供了理論依據(jù)。 為此，本研究應(yīng)用酶組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR等技術(shù)研究了肝癌前病變的一些基本病理改變及Notch信號通路的變化，觀察了清肝化瘀方藥對肝癌前病變的阻斷作用及對Notch信號通路的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)應(yīng)用血清藥理學(xué)方法，探討了清肝化瘀方含藥血清誘導(dǎo)大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F344 細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞定向分化的作用，推測此作用可能是通過調(diào)節(jié)Notch信號通路實(shí)現(xiàn)的。 第一部分清肝化瘀方藥對大

5、鼠肝癌前病變的阻斷作用 目的：觀察大鼠肝癌前病變的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、酶學(xué)、蛋白表達(dá)的改變，了解肝癌前病變期的基本病理改變以及清肝化瘀方藥對肝癌前病變的阻斷作用。 方法 1．90只大鼠隨機(jī)分為4組：A：模型組；B：清肝化瘀方藥等效劑量組；C：清肝化瘀方藥大劑量組；D：苦參堿組；E組：正常對照組。A、B、C、D組采用腹腔注射二乙基亞硝胺(Diethvlnitrosamine，DEN)+2/3肝切除方法復(fù)制大鼠肝癌

6、前病變模型，B、C、D組同時(shí)分別給予不同劑量清肝化瘀方藥和苦參堿灌胃，7周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 2．應(yīng)用蘇木素-伊紅(Hematoxin eosin，HE)染色觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變；透射電鏡觀察病變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；酶組織化學(xué)觀察各組肝組織γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Glutamyl-transpeptidase，γ-GTase)、三磷酸腺苷酶(Adenosine triphosphatase，ATPase)、葡萄糖-6-磷酸酶(G

7、lcose-6-phosphatase，G-6-Pase)分布及定量比較；免疫組織化學(xué)觀察各組Thy-1(CD90)、白蛋白(Albumin，ALB)、甲胎球蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)分布及定量比較。 結(jié)果 1．HE染色：7周末模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)消失，匯管區(qū)小膽管增生，沿小膽管外側(cè)可見卵圓細(xì)胞大量增生，有的卵圓細(xì)胞以匯管區(qū)為中心向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)爬伸樣生長，破壞鄰近肝板；B、C、D組肝小葉結(jié)構(gòu)存在，可見

8、少量變異肝細(xì)胞，卵圓細(xì)胞增生較少，C組病理改變最輕。 2．透射電鏡：卵圓細(xì)胞可分為三型，從Ⅰ型到Ⅲ型細(xì)胞體積逐漸增大，胞內(nèi)細(xì)胞器逐漸豐富，細(xì)胞內(nèi)的張力微絲及細(xì)胞間的橋粒聯(lián)接為卵圓細(xì)胞的特征性結(jié)構(gòu)。 3．酶組化染色：γ-GTase：A組可見多處位于匯管區(qū)周圍或肝小葉內(nèi)鮮艷的橢圓形玫瑰紅色陽性反應(yīng)灶。B、C、D組病灶著色明顯較淡，病灶范圍小，A、B、C、D組單位面積內(nèi)病灶面積為(mm<'2>/cm<'2>，單位下略)：8.2

9、4±0.53、4.39±0.48、3.16±0.53、3.25±0.47，B、C、D組有明顯抑制γ-GT酶變灶的作用(P<0.05或P<0.01)，C、D組較B組作用更明顯(P<0.01)，C、D組之間無顯著差異(P>0.05)。ATPase、G-6-Pase：A組均可見到位于肝小葉內(nèi)的橢圓形陰性反應(yīng)灶，B、C、D組病灶范圍均縮小。 4.免疫組化染色：E組中Thy-1、AFP蛋白表達(dá)陰性，A組Thy-1、AFP蛋白在匯管區(qū)或肝小

10、葉內(nèi)高表達(dá)，B、C、D組表達(dá)下調(diào)；ALB在E組肝組織中均勻彌漫陽性表達(dá)，在A組中表達(dá)明顯減少，B、C、D組表達(dá)上調(diào)，A-E組光密度值分別為：Thy-1：150.49±9.45、135.16±6.15、103.83±3.72、102.70±7.75、79.19±6.32：AFP：130.34±10.50、113.38±8.20、89.29±7.05、84.94±5.08、62.82±7.00：ALB：108.79±9.31、130.50±

11、12136、157.47±6.81、159.86±9.74、186.84±9.75。B、C、D組與A組比較有明顯差異(P<0.05或P<0.01)，C、D組較B組作用更明顯(P<0.01)，C、D組之間無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論 1.大鼠肝癌前病變階段具有典型的病理改變特點(diǎn)，卵圓細(xì)胞大量增生為特征性改變，清肝化瘀方藥和苦參堿可減輕上述病變。 2．根據(jù)酶組化染色結(jié)果推測肝癌前病變機(jī)理為細(xì)胞氨基酸分子轉(zhuǎn)運(yùn)及合

12、成過度活躍、Ca<'2+>內(nèi)流、糖代謝紊亂等，而清肝化瘀方藥及苦參堿可能是通過抑制病變細(xì)胞氨基酸的過度轉(zhuǎn)運(yùn)合成、抑制Ca<'2+>內(nèi)流、穩(wěn)定糖代謝等機(jī)制起到阻斷癌前病變作用的。 3．根據(jù)免疫組化染色結(jié)果推測在肝癌前病變期出現(xiàn)大量具有原始干細(xì)胞特性的細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)某些肝癌細(xì)胞的特征，清肝化瘀方藥和苦參堿可能具有誘導(dǎo)某些原始干細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞發(fā)育分化的作用。 第二部分清肝化瘀方藥對肝癌前病變大鼠 Notch信號通路的影響

13、 目的：了解大鼠肝癌前病變期Notch信號分子的蛋白、基因表達(dá)情況以及清肝化瘀方藥對Notch信號分子的調(diào)節(jié)作用，探討Notch信號通路對肝癌前病變的作用以及清肝化瘀方藥阻斷肝癌前病變的分子機(jī)制。 方法 1．實(shí)驗(yàn)分組同第一部分，免疫組化方法觀察各實(shí)驗(yàn)組肝組織Notchl受體Jaggedl配體蛋白定位、定量表達(dá)情況。 2．半定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription- polym

14、erasechain reaction，RT-PCR)方法觀察各實(shí)驗(yàn)組肝組織AFPmRNA、ALBmRNA、NotchlmRNA、JaggedlmRNA、RBP-J k mRNA、Hes-lmRNA表達(dá)情況。 結(jié)論：在肝癌前病變期Notch信號通路各分子蛋白及基因均高表達(dá)，經(jīng)清肝化瘀方藥和苦參堿干預(yù)后表達(dá)逐漸減低，提示清肝化瘀方藥和苦參堿可能是通過調(diào)節(jié)Notch信號通路起到阻斷肝癌前病變作用。 第三部分清肝化瘀方含藥血清

15、對大鼠肝卵圓細(xì)胞WB- F344 細(xì)胞增殖及Notch信號通路的調(diào)控作用 目的：了解在體外培養(yǎng)的大鼠肝卵圓細(xì)胞株 WB F-344細(xì)胞上Notch信號的表達(dá)情況及清肝化瘀方含藥血清對 WB F-344細(xì)胞表達(dá)Notch信號分子的調(diào)節(jié)作用，探討清肝化瘀方含藥血清對該細(xì)胞分化發(fā)育的影響。 方法 1.含藥血清的制備及分組：各組動(dòng)物造模及給藥方法同第一部分，7周末給藥后2h麻醉動(dòng)物，下腔靜脈無菌取血，分離血清，抽濾除菌，

16、-80℃凍存?zhèn)溆谩?A：肝癌前病變模型組血清；B：清肝化瘀方含藥血清；C：苦參堿含藥清；D：正常大鼠血清對照組。 2.MTT法檢測清肝化瘀方含藥血清和苦參堿含藥血清對WB F-344細(xì)胞株增殖影響。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測清肝化瘀方含藥血清和苦參堿含藥血清對WBF-344 細(xì)胞表達(dá)AFP、ALB、Notchl蛋白的影響。 4.RT-PCR檢測清肝化瘀方含藥血清和苦參堿含藥血清對WB F-344 細(xì)胞表達(dá)AFPm

17、RNA、ALBmRNA、NotchlmRNA、HESlmRNA的影響。 結(jié)論 1.清肝化瘀方藥含藥血清和苦參堿含藥血清有抑制WB F-344 細(xì)胞增殖的作用，清肝化瘀方藥含藥血清較苦參堿含藥血清作用更明顯。 2.清肝化瘀方藥含藥血清和苦參堿含藥血清可下調(diào)WB F-344 細(xì)胞Notch信號分子、AFP的蛋白及基因表達(dá)，誘導(dǎo)ALB蛋白及基因表達(dá)，清肝化瘀方藥含藥血清較苦參堿含藥血清作用更明顯。推測清肝化瘀方藥含藥血