Nrf2在慢性阻塞性肺疾病中的作用及其與IKKα-β的關(guān)系.pdf

1、第一部分動物部分Nrf2在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中的作用及與IKKα/β的關(guān)系 目的:探討核因子Nrf2在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病中的作用及與NF-KB和IKKα/β之間的關(guān)系。 方法:36只Wistar大鼠隨機分為A，B，C三個組，各12只，A組為對照組，B組為慢性阻塞性肺疾病模型組，C組為15d-PGJ2干預(yù)組，采用熏煙+氣管內(nèi)滴注脂多糖的方法建立模型；C組在建立模型的基礎(chǔ)上第1天和第14天靜脈注射15d-PGJ2(0

2、.3 mg/kg)干預(yù)。各組分別進行一般情況的觀察，30天后檢測大鼠肺功能，經(jīng)微機處理計算出FEVO.3/FVC、R1及Cdyn。測定肺功能后，進行肺泡灌洗左肺，取其上清液，檢測總抗氧化能力和SOD的檢測。取左肺組織固定、病理切片，部分HE染色光鏡觀察病理改變結(jié)果，部分切片免疫組化和右肺抽提mRNA，RT-PCR法檢測Nrf2，NF-KB p65和IKKα/β的表達(dá)。所有結(jié)果應(yīng)用SPSS12.0軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果:(1

3、)慢性阻塞性肺疾病的大鼠模型成功，模型組大鼠FEV0.3/FVC(％)和Cdyn(動態(tài)肺順應(yīng)性)明顯低于正常對照組，差異有顯著性(均P

4、均有統(tǒng)計學(xué)意義。(3)大鼠肺及支氣管組織的病理學(xué)觀察模型組病理切片示模型組的肺組織破壞、增殖及炎癥程度明顯大于對照組，干預(yù)組介于兩者之間。(4)免疫組化測得模型組中Nrf2、NF-KBp65和IKKa/p的陽性表達(dá)明顯高于對照組，干預(yù)組NF-KBp65和IKKa/p介于兩者之間，而與Nrf2的表達(dá)明顯高于模型組，差異有顯著性(均P<0.05)。(5) RT-PCR測得模型組中Nrf2、NF-KB p65和IKKp的mRNA的表達(dá)明顯高于

5、對照組，干預(yù)組NF-KBp65和IKKp介于兩者之間，而與Nrf2的表達(dá)明顯高于模型組，差異有顯著性(均P<0.05)，IKKα在三組中都無顯著異常。 結(jié)論:(1)采用被動香煙吸入以及氣管內(nèi)注入脂多糖，成功復(fù)制了COPD大鼠模型。 (2)COPD模型組中15d-PGJ2有抗氧化應(yīng)激和抗炎癥的作用，這一作用可能與Nrf2的增加有關(guān)。 (3) Nrf2可能通過抑制IKKβ的表達(dá)，而抑制NF-K Bp65的表達(dá)水平。

6、 第二部分細(xì)胞部分Nrf2通過抑制IKKβ途徑下調(diào)支氣管上皮細(xì)胞NF-K Bp65和IL-8的表達(dá) 目的:探討香煙煙霧提取物刺激后支氣管上皮細(xì)胞后Nrf2的表達(dá)，及其是否通過IKKB途徑下調(diào)氣道上皮細(xì)胞NF-K Bp65和IL-8的表達(dá)。 方法:培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞分為7組A:正常對照組；B:煙草提取物(CSE)刺激組；C：15d-PGJ2預(yù)處理后CSE刺激組；D: Nrf2siRNA后CSE刺激組；E:陰性干擾后C

7、SE刺激組F組和G組為IKKInhibitor抑制后的C和D組。首先通過煙草提取物的刺激使細(xì)胞氧化應(yīng)激的水平增加，再通過15d-PGJ2預(yù)處理和Nrf2siRNA的方法來增加或降低Nrf2的水平，并用RT-PCR法及westblot的方法觀察各組細(xì)胞NF-K Bp65和IL-8的表達(dá)與Nrf2的表達(dá)的關(guān)系，及抑制IKKs后NF-K Bp65和IL-8的表達(dá)及與Nrf2的表達(dá)的關(guān)系。所有結(jié)果應(yīng)用SPSS12.O軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

8、 結(jié)果:(1)支氣管上皮細(xì)胞在CSE的刺激下，Nrf2、IKKα/β、NF-K b p65以及IL-8的表達(dá)水平均有明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)在支氣管上皮細(xì)胞中，PGJ2可增加Nrf2的表達(dá)，而Nrf2siRNA可成功抑制了Nrf2的表達(dá)。Nrf2的表達(dá)增加，同時伴有IKKα/β、NF-K Bp65和IL-8的明顯降低；Nrf2的表達(dá)被抑制后，同時伴有IKKα/β、NF-K Bp65和IL-8的明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這

9、些變化在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平是一致的。(3)用IKK inhibitor進行干 預(yù)后發(fā)現(xiàn)，PGJ2仍然可以增加Nrf2的表達(dá)，而Nrf2siRNA也可成功抑制了Nrf2的表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄水平，IKK被抑制后，IKKα/β、NF-K Bp65和IL-8的都有明顯的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是并不隨著Nrf2的增加而降低，同時也不伴隨Nrf2的降低而升高。 結(jié)論:(1) Nrf2在支氣管上皮細(xì)胞中有抗炎癥作用。(2)Nrf2抑制炎