基于調節(jié)P-AKT1、FⅧR-Ag的腦脈通對老齡大鼠腦缺血-再灌注損傷腦微血管生成機制研究.pdf

1、背景:缺血性腦血管病（ICVD）作為臨床常見的危急重病之一，其高致殘率及高死亡率已嚴重威脅人類健康。目前，大量的研究集中于挽救和改善神經元存活和功能恢復，而有關腦缺血后腦微血管再生、微循環(huán)重建等方面，較少引起關注。在腦缺血早期，通過血管生成以建立新的血管網，恢復缺血區(qū)的血供，將能挽救瀕死的神經元，促進神經功能的恢復。血管新生可通過多種蛋白因子或信號轉導通路的調節(jié)，而PI3K/AKT作為細胞內重要的信號轉導通路，常作為改善腦血管病患者預后

2、的一個重要的治療靶點。腦缺血后自身“代償性血管再生”為缺血性腦血管病的病理機制研究提供了新的思路，但由于這種自然代償過程緩慢，且產生的側枝循環(huán)常灌注不足，不能挽救瀕死的神經元而導致神經功能的損害，因此，選取有效的藥物或其他干預手段促進缺血后血管生成顯得尤為重要。近年來，關于中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病的研究較多，且已獲得一定的療效，雖然其作用機制相當復雜，但促進血管再生可能是其重要作用機制之一。而本課題前期實驗已證實，中藥復方腦脈通對缺血再

3、灌注損傷有顯著的保護作用，促進缺血區(qū)血管新生是其保護腦損傷的重要途徑。因此，本課題在以前研究的基礎上，從p-Akt1及FⅧR:Ag表達變化方面探討老齡大鼠腦缺血/再灌注腦微血管生成機制，并以此為切入點進一步闡釋中藥復方腦脈通對微血管生成的促進作用及其可能的作用機制。
　　目的:
　　1.以SD大鼠為研究對象，采用線栓法制備局灶性大腦中動脈腦缺血動物模型，觀察腦缺血再灌注損傷后青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24

4、h、3d、6d、12d行為學改變及腦血管超微結構變化；研究腦脈通對老齡大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用。
　　2.采用免疫組織化學方法檢測青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d腦微血管p-Akt1表達變化；研究腦脈通對老齡大鼠腦缺血再灌注損傷p-Akt1表達變化的影響。
　　3.采用免疫組織化學方法檢測青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d腦微血管FⅧR:A

5、g表達變化；研究腦脈通對老齡大鼠腦缺血再灌注損傷FⅧR:Ag表達變化的影響。
　　方法:
　　1.采用MCAO線栓法復制大鼠局灶性腦缺血3h，再灌注24h、3d、6d、12d動物模型，觀察腦缺血3h，再灌注1d、3d、6d、12d神經功能評分、并通過電鏡觀察各組大鼠在腦I/R后不同時間點腦組織超微結構變化，以進一步探討腦脈通對老齡大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織病理改變的影響。
　　2.采用MCAO線栓法復制大鼠局灶性腦缺

6、血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動物模型，運用免疫組織化學方法比較各組大鼠在腦缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后腦組織p-Akt1的表達變化，觀察腦脈通對老齡大鼠缺血再灌注后p-Akt1表達變化的影響。
　　3.采用MCAO線栓法復制大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動物模型，運用免疫組織化學方法比較各組大鼠在腦缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后腦組織FⅧ:Ag的

7、表達變化，觀察腦脈通對老齡大鼠缺血再灌注后FⅧ:Ag表達變化的影響。
　　結果:
　　1.老齡大鼠腦缺血/再灌注（I/R）后神經功能評分、腦組織超微結構變化及腦脈通對其表達的影響
　　1.1各組大鼠腦缺血后神經功能綜合評分：青年模型組各時間點大鼠神經功能評分均低于青年假手術組。青年模型組I/R1d、3d、6d、12d組神經功能評分均低于青年模型組I3h；青年模型組I/R3d、6d神經功能評分低于青年模型組I/R1d，青

8、年模型組I/R12d神經功能評分高于青年模型組I/R1d；青年模型組I/R6d神經功能評分低于青年模型組I/R3d，青年模型組 I/R12d神經功能評分高于青年模型組 I/R3d；青年模型組I/R12d神經功能評分高于青年模型組I/R6d。老齡模型組各時間點大鼠神經功能評分均低于老齡假手術組。老齡模型組I/R1d、3d、6d、12d組神經功能評分均低于老齡模型組I3h；老齡模型組I/R3d、6d神經功能評分低于老齡模型組I/R1d，老齡

9、模型組I/R12d神經功能評分高于老齡模型組I/R1d；老齡模型組I/R6d神經功能評分低于老齡模型組I/R3d，老齡模型組 I/R12d神經功能評分高于老齡模型組 I/R3d；老齡模型組I/R12d神經功能評分高于老齡模型組I/R6d。與老齡模型組相同時間點比較，腦脈通組及尼莫地平組神經功能障礙評分均增高。腦脈通組I/R1d、3d、6d、12d組神經功能評分均低于腦脈通組I3h；腦脈通組I/R3d、6d神經功能評分低于腦脈通組I/R1

10、d，腦脈通組I/R12d組神經功能評分高于腦脈通組I/R1d；腦脈通組I/R6d組神經功能評分低于腦脈通組 I/R3d，腦脈通組 I/R12d組神經功能評分高于腦脈通組I/R3d；腦脈通組I/R12d神經功能評分高于腦脈通組I/R6d。與尼莫地平組相同時間點比較，腦脈通組I/R1d、I/R3d、I/R6d神經功能障礙評分均增加。
　　1.2各組大鼠腦缺血后腦組織超微結構的變化:青年假手術組大鼠腦皮質微血管結構完整，基膜及管周均無水

11、腫。血管基底膜連續(xù)完整，無溶解、斷裂、卷曲、脫落、缺失等。內皮細胞胞漿正常，無水腫。線粒體結構清淅，無腫脹、斷裂。粗面內質網結構正常。青年模型組可見管周圍輕度水腫（I3h、I/R6d、 I/R12d，照片2、5、6）、中重度水腫（I/R1d、 I/R3d，照片3、4）。內皮細胞線粒體可輕度水腫（I3h、I/R6d、I/R12d，照片2、5、6）。基底膜部分扭曲，基底膜部分水腫（I/R1d、I/R3d，照片3、4），血管基底膜溶解、斷裂、

12、缺損（I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片3-5）。老齡假手術組大鼠腦皮質微血管結構完整，基膜及管周無明顯水腫，血管基底膜連續(xù)完整，無溶解、斷裂、卷曲、脫落、缺失等（照片7）。老齡模型組可見管周圍輕度水腫（I/R6d、I/R12d，照片11、12）、中重度水腫（I3h、I/R1d、I/R3d，尤以I/R3d最重，照片8-10）。內皮細胞線粒體水腫（I3h、I/R1d、I/R6d，照片8、9、11）。血管基底膜溶解、斷裂、缺損（I3h

13、、I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片8-11）。腦脈通組可見管周圍輕度水腫（I/R6d，照片16），內皮細胞線粒體水腫（I3h、I/R1d、I/R6d，照片13、14、16）。尼莫地平組內皮細胞線粒體水腫（I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d，尤以I/R12d最重，照片18-22）。
　　2.老齡大鼠腦缺血/再灌注損傷 p-Akt1表達變化及腦脈通對其表達的影響
　　青年模型組各時間點大鼠p-Akt

14、1表達水平強于青年假手術組。青年模型組I/R1d、6d表達強于青年模型組I3h，青年模型組I/R3d、12d表達弱于青年模型組I3h；青年模型組I/R6d表達強于青年模型組I/R1d，青年模型組I/R3d、12d表達弱于青年模型組I/R1d；青年模型組I/R6d表達強于青年模型組I/R3d；青年模型組I/R12d表達弱于青年模型組I/R6d。與青年模型組相同時間點比較，老齡模型組p-Akt1表達均減弱。老齡模型組各時間點大鼠p-Akt1

15、表達水平強于老齡假手術組。老齡模型組I/R1d、6d表達強于老齡模型組I3h，老齡模型組I/R12d表達弱于老齡模型組I3h；老齡模型組I/R6d表達強于老齡模型組I/R1d，老齡模型組I/R3d、12d表達弱于老齡模型組I/R1d；老齡模型組I/R6d表達強于老齡模型組I/R3d，老齡模型組I/R12d表達弱于老齡模型組I/R3d；老齡模型組I/R12d表達弱于老齡模型組I/R6d。與老齡模型組相同時間點比較，腦脈通組及尼莫地平組p-

16、Akt1表達水平增強。腦脈通組I/R1d、3d、6d、12d表達均強于腦脈通組I3h；腦脈通組I/R6d表達強于腦脈通組I/R1d，腦脈通組I/R3d、12d表達弱于腦脈通組I/R1d；腦脈通組I/R6d、12d表達強于腦脈通組I/R3d；腦脈通組I/R12d表達弱于腦脈通組I/R6d。
　　3.老齡大鼠腦缺血/再灌注損傷FⅧR:Ag表達變化及腦脈通對其表達的影響
　　青年模型組各時間點大鼠FⅧR:Ag表達水平均強于青年假手

17、術組。青年模型組I/R3d、6d表達均強于青年模型組I3h，青年模型組I/R1d表達弱于青年模型組I3h；青年模型組I/R3d、6d、12d表達均強于青年模型組I/R1d；青年模型組I/R6d表達強于青年模型組I/R3d;青年模型組I/R12d表達弱于青年模型組I/R3d；青年模型組I/R12d表達弱于青年模型組I/R6d。與青年模型組相同時間點比較，老齡模型組FⅧR:Ag表達水平降低。老齡模型組各時間點表達均較老齡假手術組增強。老齡模

18、型組I/R3d、6d大鼠表達強于老齡模型組I3h，老齡模型組I/R1d表達弱于老齡模型組I3h；老齡模型組I/R3d、6d、12d表達強于老齡模型組I/R1d；老齡模型組I/R6d表達強于老齡模型組I/R3d，老齡模型組I/R12d表達弱于老齡模型組I/R3d；老齡模型組I/R12d表達弱于老齡模型組I/R6d。腦脈通組及尼莫地平組各時間點大鼠FⅧR:Ag表達水平均強于老齡模型組。腦脈通組I/R3d、6d、12d表達均強于腦脈通組I3h

19、，腦脈通組I/R1d表達弱于腦脈通組I3h；腦脈通組I/R3d、6d、12d表達強于腦脈通組I/R1d；腦脈通組I/R6d表達強于腦脈通組I/R3d；腦脈通組I/R12表達弱于腦脈通組I/R3d。
　　結論:
　　1.通過對腦缺血/再灌注損傷后老齡大鼠神經功能癥狀及腦組織超微結構變化的觀察，與青年模型組相同時間點比較，老齡模型組大鼠腦I/R后組織損傷出現較早，損傷程度較重，且恢復較慢。而隨著大鼠缺血再灌注時間的延長，各組大鼠