基于調(diào)節(jié)α-SMA、CD133的腦脈通對I-R老齡大鼠腦微血管生成的實驗與臨床研究.pdf

1、背景：
　　腦梗死（cerebral infarction）又稱缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke），是各種原因?qū)е履X動脈血流中斷，局部腦組織因為缺氧缺血發(fā)生壞死，而引起相應(yīng)神經(jīng)功能障礙。腦缺血發(fā)生后如果能及時在再灌注時間窗內(nèi)恢復(fù)缺血半暗帶區(qū)的血氧供應(yīng)，可以為神經(jīng)及突觸再生提供營養(yǎng)，改善患者的神經(jīng)功能。然而，隨著缺血區(qū)血液供應(yīng)的恢復(fù)，也可能加重組織損傷和功能障礙，即缺血再灌注損傷（Ischemic re

2、perfusion，I/R）。研究表明，在腦缺血再灌注損傷后，可以啟動內(nèi)源性血管生成機制，建立側(cè)枝循環(huán)，適應(yīng)腦組織缺血缺氧損傷，甚至抵御損傷進一步加重，并促進神經(jīng)元的恢復(fù)，所以，調(diào)控內(nèi)源性血管生成，重建缺血區(qū)血管網(wǎng)絡(luò)，對改善腦部供血和促進神經(jīng)功能恢復(fù)至關(guān)重要。血管新生即新生的毛細(xì)血管從已存在的血管側(cè)枝中出芽及再塑，是一個復(fù)雜的生理病理過程，包括以下幾個連續(xù)的環(huán)節(jié)[1]：①EC上的生長因子受體被激活，活化的EC通透性增加，基底膜溶解；②E

3、C增生、遷移并增殖萌芽；③官腔再塑，血管平滑肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等增殖、分化形成成熟的血管腔。EPC是可以直接分化為 EC的前體細(xì)胞，EPC的數(shù)量和功能可以作為反映 EC的標(biāo)志物[2]。本文分為動物實驗和臨床觀察兩個部分，首先在前期研究的基礎(chǔ)上，建立腦缺血再灌注模型，在中藥腦脈通的干預(yù)下分別采用α-smooth muscle action(α-SMA)和CD133作為血管平滑肌細(xì)胞（（vascular smooth muscle cel

4、ls，VSMC））和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPS）的標(biāo)記，來反映大鼠腦缺血后梗死區(qū)的血管新生。同時對腦脈通治療老年腦梗死患者的臨床進行評價分析，并檢測老年腦梗死患者外周血CD133的表達，探索腦脈通對腦缺血損傷的作用。本課題對深入研究老年患者缺血性腦卒中的病理生理特點，探索中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的作用途徑和在血管生成方面的影響，具有重要的社會意義及醫(yī)學(xué)價值。
　　目的：
　

5、　1.以SD大鼠為研究對象，應(yīng)用線栓法制備局灶性大腦中動脈腦缺血動物模型，觀察I/R損傷后青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d腦血管超微結(jié)構(gòu)變化，并研究腦脈通對老齡大鼠I/R的保護作用；
　　2.通過研究青年模型組、老齡模型組、尼莫地平組、腦脈通組大鼠I3h、I/R24h、I/R3d、I/R6d、I/R12d大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶微血管α-SMA的表達變化，揭示老齡大鼠I/R腦微血管生成的特點及腦脈通

6、對其影響；
　　3.通過研究青年模型組、老齡模型組、尼莫地平組、腦脈通組大鼠I3h、I/R24h、I/R3d、I/R6d、I/R12d缺血區(qū)CD133陽性表達，探索老齡大鼠I/R微血管生成的特點，揭示血管內(nèi)皮祖細(xì)胞與血管再生的關(guān)系及腦脈通對其影響；
　　4.通過觀察老年腦梗死患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天NHISS量表評分及中醫(yī)癥狀量化表評分，研究腦脈通對老年腦缺血患者神經(jīng)功能的影響；
　　5.通過檢測老年腦

7、梗死患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天外周血CD133陽性表達百分比的變化，研究老年腦梗死患者外周血CD133的表達變化及腦脈通對其影響。
　　方法
　　1.采用MCA線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動物模型，通過電鏡觀察各組大鼠在腦I/R后不同時間點腦組織超微結(jié)構(gòu)變化，探討腦脈通對老齡大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織病理改變的影響；
　　2.采用MCA線栓法制備大鼠局灶

8、性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12 d動物模型，運用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠在I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d后大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶微血管α-SMA的表達變化，研究腦脈通對老齡大鼠I/R微血管α-SMA表達變化的影響；
　　3.采用MCA線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12 d動物模型，運用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠腦缺血3h再灌注1d、3d

9、、6d、12d后大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶CD133表達變化，研究腦脈通對老齡大鼠I/R腦組織CD133表達的影響；
　　4.對入選的72例缺血性腦卒中患者進行臨床觀察，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，分為腦脈通組和對照組，測各組患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天NHISS量表評分及中醫(yī)癥狀量化表評分，研究腦脈通對老年腦缺血患者神經(jīng)功能的影響；
　　5.用流式細(xì)胞儀檢測入選患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天外周血CD133陽性標(biāo)記，研

10、究腦脈通對老年腦梗死患者外周血 CD133表達的變化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.老齡大鼠腦缺血再灌注后腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化及腦脈通對其影響
　　青年假手術(shù)組大鼠電鏡觀察結(jié)果示血管基底膜連續(xù)完整，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，胞漿內(nèi)見吞飲小泡；青年模型組可見基膜、線粒體及血管周圍不同程度的水腫，在 I/R1d、 I/R3d程度最重，I/R6d、I/R12d逐漸減輕；老年假手術(shù)組微血管周圍無明顯水腫，線粒體結(jié)構(gòu)基

11、本完整，吞咽小泡減少；老齡模型組可見血管周圍、細(xì)胞質(zhì)及線粒體水腫，尤以I/R3d最重；尼莫地平組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體水腫，尤以I/R12d最重；腦脈通組可見管周圍輕度水腫，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體水腫，在I/R12d明顯減輕。
　　2.老齡大鼠腦I/Rα-SMA蛋白表達時程變化及腦脈通對其表達的影響
　　由實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青、老年假手術(shù)組均可見α-SMA少量陽性表達；青年模型組I/R1d時陽性表達開始上升，I/R6d、I/R12d維持在較高水

12、平；與青年模型組相比較，老齡模型組I3h、I/R1d、I/R3d、I/R12d表達均低于青年模型組（P<0.05，P<0.01）；與老齡模型組相同時間點比較，腦脈通組和尼莫地平組α-SMA陽性表達都高于老齡模型組（P<0.05）。
　　3.老齡大鼠腦I/R CD133蛋白表達時程變化及腦脈通對其表達的影響
　　由實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青、老年假手術(shù)組均可見CD133少量陽性表達，在I/R1d時陽性表達開始上升，I/R6d最高，I/R

13、12d開始下降；與青年模型組比較，老齡模型組相同時間點CD133的表達較低，在I/R3d、I/R6d時具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；與老齡模型組同時間點相比，尼莫地平及腦脈通組大鼠腦組織 CD133陽性表達水平均增高（P<0.05，P<0.01）；與尼莫地平組同時間相比，腦脈通組I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d大鼠腦組織CD133陽性表達水平增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.腦脈通對腦梗死患者

14、NHISS量表評分及中醫(yī)癥狀分級量表變化的影響
　　經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn)：與對照組相同時間點比較，治療14天、治療28天腦脈通組NHISS量表評分低于對照組（P<0.05.）；與對照組相同時間點比較，治療14天、治療28天腦脈通組中醫(yī)癥狀分級量表評分低于對照組（P<0.05.）。
　　5.腦脈通對老年腦梗死患者外周血CD133的表達時程變化的影響
　　經(jīng)流失細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：老年腦梗死患者14d外周血CD133表達最多，并且腦

15、脈通組高于對照組（P<0.01），28dCD133表達較14天降低（P<0.01），仍高于入院當(dāng)天（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.在遭受相同條件的I/R損傷時，與青年模型組相比，老齡模型組相應(yīng)時間的大鼠損傷出現(xiàn)較早，損傷較重，恢復(fù)慢；與老齡模型組相比，腦脈通組和尼莫地平組腦組織病理損傷程度較輕，尤以腦脈通組大鼠腦組織損傷程度最輕，修復(fù)最快，提示腦脈通可明顯改善老齡大鼠腦I/R后組織的損傷，并促進神經(jīng)功能修復(fù)；

16、　　2.老齡大鼠腦I/R損傷后，腦組織內(nèi)可見微血管生成標(biāo)記物α-SMA蛋白的表達，且隨腦 I/R時間的延長，表達逐漸增多；與老齡模型組相比，腦脈通組和尼莫地平組相對應(yīng)時間點α-SMA蛋白的表達水平增高，尤以腦脈通組顯著，提示腦脈通促進老齡大鼠腦I/R后微血管生成；
　　3.老齡大鼠腦I/R損傷后，腦組織內(nèi)可見微血管生成標(biāo)記物CD133蛋白的表達，且隨腦I/R時間的延長，表達逐漸增多，I/R12d時開始下降；與老齡模型組相比，腦脈通

17、組和尼莫地平組相對應(yīng)時間點 CD133蛋白的表達水平增高，尤以腦脈通組顯著，提示腦脈通促進老齡大鼠腦 I/R后微血管生成；
　　4.老年腦缺血患者在發(fā)病急性期NHISS量表評分及中醫(yī)癥狀分級量化表評分最高，隨著腦缺血時間的延長，評分逐漸降低，腦脈通組比較明顯，提示腦脈通可以改善老年腦缺血患者神經(jīng)功能；
　　5.老年腦缺血患者在發(fā)病急性期外周血可見CD133表達，在治療14天陽性表達最高，治療28天有所下降，腦脈通組比較明顯，