2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,有著重要的生物學(xué)效應(yīng)。其中,鈣庫(kù)控制的鈣內(nèi)流(SOCE)是非興奮性細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的主要機(jī)制,其有著重要的生物學(xué)意義,參與體內(nèi)許多生理反應(yīng):細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的充盈,酶類的激活,基因的表達(dá),細(xì)胞活素類的釋放等。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),STIM1(stromal interaction molecule 1),即基質(zhì)交感分子1,在SOCE中起到很重要的作用。
   STIM1 最先是由于其腫瘤抑制作用被人們所關(guān)注

2、,其在免疫缺陷病及多類腫瘤中起著重要作用,但是新近的研究發(fā)現(xiàn)STIM1對(duì)細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。
   STIM1是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白,含有幾個(gè)保守的且重要的結(jié)構(gòu)域:位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的EF-hand和sterile a motif(SAM),測(cè)序表明,從蠕蟲到蝶類再到人類EF-hand和SAM是很保守的結(jié)構(gòu)域;位于胞漿中的卷曲螺旋區(qū)和脯氨酸,賴氨酸富集區(qū)。
   STIM1N端的EF-hand是一鈣

3、離子感受器--可以感受ER中Ca2+的變化:Ca2+充盈時(shí),EF-hand以單聚體的形式存在,這種單體有著致密的α螺旋結(jié)構(gòu);當(dāng)Ca2+排空時(shí),EF-hand的緊密螺旋結(jié)構(gòu)減少,促進(jìn)二聚體和低聚物的形成。其它的結(jié)構(gòu)域,如SAM,卷曲螺旋區(qū)和脯氨酸賴氨酸富集區(qū)在STIM1 顆粒的轉(zhuǎn)位及激活胞膜上的SOC通道有著至關(guān)重要的作用。
   ER 利用鈣泵ATP酶行使攝取鈣和儲(chǔ)存鈣的功能,TG,即毒胡蘿卜素,是鈣泵ATP酶的抑制劑,即鈣庫(kù)不

4、能攝取鈣并儲(chǔ)存,能夠達(dá)到鈣庫(kù)排空的目的。
   ER鈣庫(kù)充盈時(shí),通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)或是融合蛋白STIM1-YFP的過(guò)表達(dá)方法發(fā)現(xiàn)STIM1主要位于胞漿,其中位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的N端EF-Hand與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+結(jié)合。在TG作用下,ER鈣庫(kù)排空時(shí),STIM1 EF-Hand與Ca2+解離,STIM1轉(zhuǎn)位于胞膜下,激活胞膜上的SOC通道,從而導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流入細(xì)胞引起一系列生理反應(yīng)。
   STIM1引起外鈣內(nèi)流入細(xì)胞的過(guò)程歸納

5、如下:⑴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STIM1作為Ca2+感受器監(jiān)測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的排空;⑵隨著鈣庫(kù)的排空,STIM1由原來(lái)的均勻分布變成聚集分布,形成顆粒,轉(zhuǎn)位至胞膜下;⑶轉(zhuǎn)位到胞膜下的STIM1引起胞膜上的Orai1聚集,進(jìn)而激活SOC通道引起外鈣內(nèi)流入細(xì)胞。更具體來(lái)說(shuō),這種信號(hào)傳遞分為四步:①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+濃度降低使STIM1的EF-hand和Ca2+解離;②與Ca2+解離后的STIM1迅速在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成低聚物;③STIM1低聚物的C端可以指引其

6、向胞膜方向移位;④移位到胞膜下的STIM1顆粒激活鈣通道。
   本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western Blot首次檢測(cè)到在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞STIM1主要分布于胞漿,在TG作用下STIM1的分布發(fā)生轉(zhuǎn)位,但是在不同的作用時(shí)間其轉(zhuǎn)位也有所不同,隨作用時(shí)間的增加呈振蕩性分布于胞漿及細(xì)胞核膜。為了進(jìn)一步驗(yàn)證STIM1在鈣庫(kù)排空后發(fā)生核轉(zhuǎn)位,本實(shí)驗(yàn)將克隆的內(nèi)皮細(xì)胞STIM1 并構(gòu)建共GFP融合表達(dá)的GFP-STIM1導(dǎo)入人臍靜脈內(nèi)

7、皮細(xì)胞,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其TG 刺激后的分布變化。另有報(bào)道稱JurkatT細(xì)胞在TG作用下STIM1發(fā)生胞膜轉(zhuǎn)位并持續(xù)相當(dāng)一段時(shí)間。那么,是什么機(jī)制導(dǎo)致兩種細(xì)胞在TG作用下分布變化的不同呢?STIM1在核鈣信號(hào)起到怎樣的作用呢?這是本課題組進(jìn)一步研究的內(nèi)容。對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)的鈣信號(hào)研究一直存在爭(zhēng)議,本實(shí)驗(yàn)的深入研究將可能為細(xì)胞核內(nèi)鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。
   目的:已有研究表明STIM1 在鈣庫(kù)排空后移位至

8、細(xì)胞膜可引起膜SOC通道開放促使Ca2+內(nèi)流。本文利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western Blot檢測(cè)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核膜或核內(nèi)是否存在STIM1 及在鈣庫(kù)排空后其轉(zhuǎn)位變化,并探討其對(duì)核鈣信號(hào)的影響。
   方法:⑴用胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用胰蛋白酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。⑵采用細(xì)胞化學(xué)免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞的內(nèi)皮來(lái)源。⑶細(xì)胞TG 刺激后應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)STIM1的分布。⑷核漿蛋白分離提取和Western

9、 blot檢測(cè)STIM1 在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的分布。⑸細(xì)胞鑒定后,利用轉(zhuǎn)染技術(shù)或是病毒感染使帶熒光的STIM1 Cdna 在內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)。⑹用2μM的TG 刺激轉(zhuǎn)染或是病毒感染成功的細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)GFP-STIM1的分布變化,分為兩組:TG 刺激組和TG 未刺激組。
   結(jié)果:①細(xì)胞的形態(tài)以及內(nèi)皮細(xì)胞八因子的特異性表達(dá)證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,且純度100%。②未刺激前,在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中ST

10、IM1主要分布于細(xì)胞胞漿,細(xì)胞核內(nèi)幾乎無(wú)表達(dá)。用1μM的TG作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,1分鐘時(shí)STIM1分布變化不明顯;3分鐘后STIM1明顯向核膜聚集;10分鐘時(shí)STIM1又恢復(fù)到未刺激前的狀態(tài),即主要分布于胞漿;作用30分鐘時(shí),STIM1再次聚集于核膜;60分鐘時(shí)其重新主要分布于胞漿。簡(jiǎn)而言之,隨著TG作用時(shí)間延長(zhǎng),STIM1的分布呈振蕩性的轉(zhuǎn)位于胞漿與核膜。③Western Blot檢測(cè)到在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,STIM1表達(dá)于胞漿,

11、核內(nèi)無(wú)表達(dá)。④通過(guò)激光共聚焦顯微鏡,在TG的刺激下檢測(cè)到GFP-STIM1的轉(zhuǎn)位變化:TG未刺激組,GFP-STIM1沒(méi)有分布變化;TG刺激后,GFP-STIM1由散在均勻分布狀變?yōu)轭w粒狀,并且向核轉(zhuǎn)位。
   結(jié)論:⑴胰蛋白酶消化法能夠成功地培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。⑵在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,STIM1主要分布于胞漿,TG刺激后,STIM1轉(zhuǎn)位于核,并隨TG作用時(shí)間的延長(zhǎng)STIM1在胞漿與核膜之間來(lái)回轉(zhuǎn)位。⑶GFP-STIM1在TG

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