STIM1、2在人臍靜脈內(nèi)皮細胞CaR介導Ca2+內(nèi)流及NO生成中的作用和機制.pdf

1、目的:探討Ca2+感受蛋白基質(zhì)相互作用分子1,2(STIM1,2)在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)鈣敏感受體(CaR)介導鈣離子(Ca2+)內(nèi)流和一氧化氮(NO)生成的作用和機制。
　　方法:(1)胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及免疫細胞化學法檢測Ⅷ因子對其進行抗原鑒定。
　　(2)取2~5代HUVEC隨機分組:
　?、賹φ战M;
　?、贑aR激動劑組(精胺+Ca2+);
　?、垅}

2、池操縱的鈣離子通道(SOC)阻滯劑組(精胺+Ca2++MRS1836或+Gd3+或+2-APB或+SKF-9636);
　　④受體操縱的鈣離子通道(ROC)阻滯劑組(精胺+Ca2++Ro31-8220與精胺+Ca2++Go6967);
　?、軷OC阻滯劑+ROC激活劑組(精胺+Ca2++Ro31-8220+TPA與精胺+Ca2++Go6967+TPA);
　?、轘OC阻滯劑+ROC阻滯劑組(精胺+Ca2++MRS184

3、5+Ro31-8220或Go6967);
　　⑦STIM1shRNA處理組:未轉(zhuǎn)染組(對照組);干擾組:shSTIM1-002組、shSTIM1-003組、shSTIM1-004組;空質(zhì)粒組(Vehicle組);
　?、郤TIM2shRNA處理組:未轉(zhuǎn)染組(對照組);干擾組:shSTIM2-001組、shSTIM2-002組、shSTIM2-003組;空質(zhì)粒組(Vehicle組)。STIM1/STIM2shRNA處理組分別與

4、含精胺+Ca2+(SOC和ROC均被激活)、含精胺+Ca2++CaR抑制劑Calhex231+ROC模擬劑OAG(阻斷SOC,激活ROC)、含精胺+Ca2++PKC抑制劑Ro31-8220或+PKCs、PKCμ抑制劑Go6967(激活SOC,阻斷ROC)的DMEM孵育20min(動態(tài)檢測)。
　　(3)針對GenBank中人來源STIM1、STIM2的cDNA序列設(shè)計并合成短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRN

5、A),取2-5代HUVEC用脂質(zhì)體法將shRNA轉(zhuǎn)染入HUVEC。采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率,Western blot方法檢測STIM1、STIM2在各加藥組中蛋白的表達及轉(zhuǎn)染后的干擾效率,Real time RT-PCR方法分別檢測STIM1、STIM2mRNA表達及干擾效率。
　　(4)免疫細胞化學技術(shù)檢測STIM1、STIM2蛋白表達及定位。
　　(5)熒光探針Fluo-2/AM負載測定細胞內(nèi)鈣離子濃度([C

6、a2+]i)的變化,NO熒光探針DAF-FMDA測定細胞內(nèi)NO生成的變化。
　　(6)實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示,組間比較用單因素方差分析,均數(shù)間的比較采用t檢驗或卡方檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析,以p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:(1)細胞形態(tài)學與免疫細胞化學法檢測Ⅷ因子證實原代培養(yǎng)的細胞為HUVEC。
　　(2)HUVEC細胞轉(zhuǎn)染48h后,熒光顯微鏡下可見成功轉(zhuǎn)染STIM1干擾

7、質(zhì)粒的細胞發(fā)出綠色熒光,成功轉(zhuǎn)染STIM2干擾質(zhì)粒的細胞發(fā)出紅色熒光。
　　(3)免疫細胞化學技術(shù)檢測顯示:STIM1、STIM2蛋白表達于胞漿,兩者共定位于胞漿。
　　(4)總蛋白Western blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,各加藥組STIM1、STIM2蛋白表達均無差異(P>0.05)。
　　(5)STIM1/STIM2 shRNA處理組Western blot檢測結(jié)果顯示:與Control組相比,Vehic

8、le組無顯著差異(p>0.05);shSTIM1-002、shSTIM1-003、shSTIM1-004組STIM1蛋白表達都降低(干擾效率分別為43％、50%、74%)(p<0.05),尤其是shSTIM1-004組STIM1蛋白表達明顯降低(p<0.05);shSTIM2-001、shSTIM2-002、shSTIM2-003組STIM2蛋白表達都降低(干擾效率分別為44%、80%、30%)(p<0.05),尤其是shSTIM2-0

9、02組STIM2蛋白表達明顯降低(p<0.05)。
　　(6)Real time RT-PCR檢測結(jié)果顯示:與Control組相比Vehicle組無顯著差異(p>0.05);shSTIM1-002、shSTIM1-003、shSTIM1-004組STIM1 mRNA表達均降低(干擾效率分別為56%、73%、91%)(p<0.05),尤其是shSTIM1-004組STIM1 mRNA表達明顯降低(p<0.05);shSTIM2-00

10、1、shSTIM2-002、shSTIM2-003組STIM2 mRNA表達亦均降低(干擾效率分別為80%、88%、41%)(p<0.05),尤其是shSTIM2-002組STIM2 mRNA表達明顯降低(p<0.05)。
　　(7)HUVEC中[Ca2+]i熒光變化值結(jié)果如下:與Control組(精胺+Ca2+組,Δratio=5.84±0.10)相比Vehicle組(Δratio=5.80±0.05)無顯著差異(p>0.05)

11、;shSTIM1-004組(Δratio=4.60±0.18)[Ca2+]i△ratio值明顯降低(p<0.05);shSTIM2-002組(Δratio=5.75±0.13)無顯著差異(p>0.05)。與Control組(精胺+Ca2++CaR抑制劑Calhex231+ROC模擬劑OAG組,Δratio=2.79±0.04)相比Vehicle組(Δratio=2.91±0.18)無顯著差異(p>0.05);shSTIM1-004組(Δ

12、ratio=1.09±0.02)[Ca2+]i△ratio值明顯降低(p<0.05)。與Control組(精胺+Ca2++PKC抑制劑Ro31-8220組,Δratio=3.15±0.10)相比Vehicle組(Δratio=2.90±0.08)無顯著差異(p>0.05);shSTIM1-004組(Δratio=1.15±0.02)[Ca2+]i△ratio值明顯降低(p<0.05)。與Control組(精胺+Ca2++PKCs、PKC

13、μ抑制劑Go6967組,Δratio=4.26±0.04)相比Vehicle組(Δratio=4.17±0.14)無顯著差異(p>0.05);shSTIM1-004組(Δratio=1.21±0.07)[Ca2+]i△ratio值明顯降低(p<0.05)。
　　(8)HUVEC中NO生成的結(jié)果如下:與Control組(精胺+Ca2+組)(1105.18±31.97)相比Vehicle組(983.33±30.33)無顯著差異(p>0

14、.05);shSTIM1-004組(160.08±11.12)NO凈熒光強度值明顯降低(p<0.05);shSTIM2-002組(1035.80±27.78)NO凈熒光強度值無顯著差異(p>0.05)。與Control組(精胺+Ca2++CaR抑制劑Calhex231+ROC模擬劑OAG組)(177.17±20.09)相比Vehicle組(179.92±16.82)無顯著差異(p>0.05);shSTIM1-004組(59.83±7.4

15、3)NO凈熒光強度值明顯降低(p<0.05)。與Control組(精胺+Ca2++PKC抑制劑Ro31-8220組)(182.66±11.93)相比Vehicle組(175.52±31.64)無顯著差異(p>0.05);shSTIM1-004組(56.27±5.71)NO凈熒光強度值明顯降低(p<0.05)。與Control組(精胺+Ca2++PKCs、PKCμ抑制劑Go6967組)(201.43±7.48)相比Vehicle組(188